[0034] 图7.双特异性抗体的生成及其功能。A)展示与缀合的（非还原）对照IgG、亲本 G37 (WT)和双特异性（G37 KIHA + PD-Ll KIHB)抗体比较，在还原条件下工程改造的（G37 KIHA)抗体的解离的蛋白凝胶。B)展示与对照IgG、亲本TOL-I (WT)和双特异性（G37 KIHA + PD-Ll KIHB)抗体比较，在还原条件下工程改造的（PD-L1 KIHB)抗体的解离的蛋白凝胶。 C)通过流式细胞术进行的双特异性抗体与CAIX+PDL-Γ SKRC-52细胞的结合的分析。
[0035] 图8. PD-Ll特异性mAb42的功能表征。将来自四个健康供体（D1-D4)的PBMC在 a TOLl (mAb42)或对照同种型抗体的存在下培养，用0.1 μ g/ml SEB刺激48小时，并通过 MSD装置测量TNFa的生成。数据以一式三份的方式呈现*，p〈〇. 〇〇〇5。
[0036] 详述 本发明提供特异性抗I3D-Ll的人源化单克隆抗体，也称为B7H1。所述抗体通过噬菌体 展示抗体文库选择的方法通过使用脂蛋白体偶联的-PD-Ll作为文库选择靶而鉴定。这些 抗体代表新一类的抗ro-Li的人单克隆抗体。
[0037] 这些抗-PD-Ll人单克隆抗体在本文中被称为"huPD-Ll抗体"。
[0038] PD-Ll与Η)-1的结合负调节T细胞抗原-特异性应答，这对自身免疫和免疫病理 学的耐受和预防是极重要的。然而，过度的ro-Li/ro-i相互作用（其可由慢性抗原刺激引 起）可导致τ细胞抗原-特异性应答的抑制和τ细胞的缺失(其为τ细胞衰竭的特征)。τ 细胞衰竭是τ细胞功能异常的状态，其可在慢性感染和癌症中产生。它定义为：弱效应子功 能、抑制性受体的持续表达和不同于功能性效应子或记忆τ细胞的转录状态的转录状态。 衰竭阻止感染和肿瘤进展的管理。
[0039] 已经在不同的癌症中检测到ro-Ll过量表达。例如，在乳腺癌中，PD-Ll被过量表 达并与高风险预后因子相关。在肾细胞癌中，PD-Ll被增量调节并且在肿瘤浸润的白细胞 中也已发现ro-Ι表达增加。抗-PD-Ll和抗-PD-I抗体在I期临床试验中对肾细胞癌已经 表现出一些临床功效。可结合至ro-ι或ro-Ll的治疗剂可用于特异性靶向肿瘤细胞。能 够阻断ro-i/PD-Li相互作用的作用剂在治疗已经诱导τ细胞衰竭以逃避抗-肿瘤τ细胞 活性的癌症中可能甚至更有用。这类作用剂的使用（单独使用或与其它抗-癌症疗法组合 使用)可有效靶向过量表达ro-Li的肿瘤细胞并增加抗-肿瘤τ细胞活性，由此提高对靶肿 瘤细胞的免疫应答。
[0040] 在慢性抗原刺激(例如，通过慢性感染)后，PD-I和ro-Ll还可被T细胞增量调节。 在慢性HIV感染期间，HIV-特异性CD8+ T细胞功能上被损害，表现出降低的产生细胞因子 和效应子分子的能力和减弱的增殖能力。ro-Ι在HIV感染个体的HIV-特异性CD8+ T细胞 上高表达。因此，阻断此通路可增强HIV-特异性T细胞在响应用HIV肽刺激时增殖和产生 细胞因子的能力，由此提高针对HIV的免疫应答。其它慢性感染也可从ro-1/PD-Ll阻断剂 的使用中受益，例如慢性病毒感染、细菌感染或寄生虫感染。
[0041] 本发明提供特异性结合ro-Li蛋白的人单克隆抗体。本发明的抗体与ro-Li的结 合干扰配体结合至它的受体roi的能力。通过多种机制，huPD-Ll抗体阻止抑制T细胞应 答的负反馈机制。在一些情况下，huPD-Ll抗体阻止、抑制或逆转T细胞衰竭。huPD-Ll抗 体的给予可导致T细胞增殖增加，抗原-特异性T细胞活性增加和效应子细胞因子的产生 增加。在一些实例中，huPD-Ll抗体促进或提高抗原-特异性免疫应答。此免疫应答可通 过效应子T细胞介导。
[0042] huPD-Ll抗体是单价的或二价的并包括单链或双链。功能上，huPD-Ll抗体的结 合亲和力在KT5 M-10_12 M的范围内。例如，huPD-Ll抗体的结合亲和力为10_6 M-10_12 M、 KT7 M-KT12 M、KT8 M-KT12 M、KT9 M-KT12 Μ、ΚΓ5Μ-ΚΓη M、KT6 M-KT11 M、KT7 M-KT11 M、 KT8 M-KT11 M、KT9 M-KT11 Μ、10' M-KT11 M、KT5 M-KT10 M、KT6 M-KT10 M、KT7 M-KT10 Μ、 KT8 M-KT10 Μ、KT9 M-KT10 Μ、KT5 M-KT9 Μ、KT6 M-KT9 Μ、KT7 M-KT9 Μ、KT8 M-KT9 Μ、KT5 M-KT8 Μ、KT6 M-KT8 Μ、KT7 M-KT8 Μ、KT5 M-KT7 Μ、KT6 M-KT7 M 或 KT5 M-KT6 Μ。
[0043] 此外，本发明的抗体包含治疗剂，其包括但不限于毒素、放射性标记、SiRNA或细胞 因子。
[0044] huPD-Ll抗体能够诱导细胞死亡。细胞死亡通过直接或间接的机制诱导。例如， PD-Ll通过huH)-Ll抗体的结合可导致补体依赖性细胞毒性（⑶C)。备选地，huPD-Ll抗体 结合H)-L1，并导致第二细胞类型的募集，其会杀伤TO-L14-表达的靶细胞。范例性机制(通 过该机制huro-Li抗体通过募集第二细胞类型介导细胞死亡）包括但不限于：抗体-依赖 性细胞毒性（ADCC)和抗体依赖性细胞吞噬（ADCP)。靶ro-Ll-表达细胞类型包括肿瘤细胞 和T细胞(例如活化的T细胞)。
[0045] 十四种独特的单克隆huH)-Ll抗体被鉴定出。这些包括Ab-14、Ab-16、Ab-22、 Ab-30、Ab-31、Ab-32、Ab-38、Ab-42、Ab-46、Ab-50、Ab-52、Ab-55、Ab-56 和 Ab-65。
[0046] 单克隆huro-Ll抗体的核酸和氨基酸序列提供如下：
[0049] 本文描述的huro-Ll抗体与ro-Ll结合。在一方面中，huPD-Ll抗体对ro-Ll具 有高亲和力和高特异性。在另一方面中，huPD-Ll抗体可结合ro-i受体并阻止、抑制或阻 断配体ro-Li结合其受体ro-i。在一些实例中，huPD-Li抗体可具有一些与ro-L2的交叉 反应性。在一些实例中，huPD-Ll抗体不显示任何与ro-L2的交叉反应性。在一些实例中， huPD-Ll抗体以与结合至ro-L2相比更高的亲和力和/或更高的特异性结合至ro-Ll。
[0050] 本发明还描述以下抗体的特征，其与本文描述的huro-Ll抗体的氨基酸或核苷酸 序列具有特定百分比的同一性或相似性。例如，当与本文描述的huro-Ll抗体的任一种的 特定区域或全长作比较时，所述抗体可具有60%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性。与本发明的核酸和蛋白的序列同一性或相似性可通 过本领域已知的方法进行的序列比较和/或比对而确定。例如，可利用序列比较算法（即 BLAST或BLAST 2. 0)、手动比对或目测确定对本发明的核酸和蛋白的百分比序列同一性或 相似性。
[0051] 对于氨基酸序列，本领域技术人员将容易地认识到，对核酸、肽、多肽或蛋白序列 的单个替代、缺失或添加(其在编码序列中变更、添加、缺失或替代单个氨基酸或小百分比 的氨基酸）在本文中被统称为"保守性修饰变体"。在一些实施方案中，所述变更导致将氨 基酸用化学上类似的氨基酸替代。提供功能上类似的氨基酸的保守性替代表在本领域为周 知的。与未修饰的huro-Ll抗体相比，本文公开的huro-Ll抗体的这类保守性修饰变体可 展示出增强的对ro-L2的交叉反应性。
[0052] 抗体 本文使用的术语"抗体"是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白（Ig)分子的免疫活性部 分，即，含特异性结合抗原（与抗原免疫反应）的抗原结合位点的分子。"特异性结合"或 "与……免疫反应"意指抗体与所需抗原的一个或多个抗原决定簇反应和不与其它多肽反 应。抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、dAb (结构域抗体）、单链抗体、 Fab、Fab，和F(ab，)2片段、scFv和F ab表达文库。
[0053] 单链Fv ("scFv")多肽分子是共价连接的￥11:'杂二聚体，其可自包含通过肽编码 的接头连接的Vh-和Vf编码基因的基因融合物表达（参见Huston等人（1988) Proc Nat Acad Sci USA 85(16) :5879-5883)。许多方法已被描述以分辨化学结构，用于将天然聚集 的、但化学上分隔开的来自抗体V区的轻多肽链和重多肽链转变成scFv分子(其可折叠成 与抗原-结合位点的结构大体上类似的三维结构)。参见，例如，美国专利号5, 091，513、 5, 132, 405 和 4, 946, 778。
[0054] 已经并且可以创建非常大的天然人scFv文库以提供抗大量靶分子的重排抗体基 因的大来源。可从患有传染性疾病的个体中构建较小的文库以便分离疾病-特异性抗体。 (参见 Barbas 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9339-43 (1992); Zebedee 等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3175-79 (1992))〇
[0055] 通常，从人获得的抗体分子涉及种类IgG、IgM、IgA、IgE和IgD的任一种，它们在 分子中存在的重链的性质上彼此不同。某些种类还具有亚类，例如IgG 1UgG2W及其它。此 外，在人中，轻链可为κ链或λ链。术语〃抗原-结合位点〃或〃结合部分〃是指免疫 球蛋白分子的一部分，该部分参与抗原结合。抗原结合位点由重（"Η")链和轻（"L")链的 N-末端可变（"V")区的氨基酸残基形成。在重链和轻链的V区内被称为〃高变区〃的三个 高度差异的伸展区（stretch)被插入在被称为〃构架区〃或"FR〃的更保守的侧翼伸展区 之间。因此，术语"FR"是指天然存在于免疫球蛋白中的高变区之间并邻接于免疫球蛋白中 的高变区的氨基酸序列。在抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空 间中相对于彼此排列以形成抗原-结合表面。抗原-结合表面与结合的抗原的三维表面互 补，并且重链和轻链的每一个的三个高变区被称为〃互补决定区〃或〃⑶R"。在图2中显示 了 scFv抗体的VH和VL区的CDR。
[0056] 本文使用的术语"表位"包括能够特异性结合至免疫球蛋白、scFv或T-细胞受体 的任何蛋白决定簇。表位决定簇通常由分子（例如氨基酸或糖侧链）的化学上有活性的表 面集簇组成，且通常具有特定的三维结构特征，和特定的电荷特征。例如，抗体可针对多肽 的N-末端或C-末端肽而产生。
[0057] 本文使用的术语〃免疫结合〃和〃免疫结合性质〃是指这样类型的非共价相互作 用，其发生在免疫球蛋白分子和抗原(对于该抗原而言免疫球蛋白为特异性的）之间。免疫 结合相互作用的强度或亲和力可以相互作用的解离常数（K d)表示，其中较小的&表示较大 的亲和力。所选多肽的免疫结合性质可使用本领域中周知的方法定量。一种这类方法牵涉 测量抗原-结合位点/抗原复合物形成和解离的速度，其中那些速度取决于复合物配偶体 的浓度、相互作用的亲和力和几何参数，所述参数同等地在两个方向上影响速度。因此，〃结 合速率常数〃 (Km)和〃解离速率常数〃 (Ktjff)两者都可通过浓度与缔合和解离的实际速度 的计算而确定。（参见Nature 361:186-87 (1993))。Ktjff /Km的比率使得与亲和力不相关 的所有参数的删除成为可能，并且等于解离常数Kd (通常参见Davies等人（1990) Annual Rev Biochem 59:439-473)。当平衡结合常数（Kd)为彡10 μ M，优选为彡10 nM，更优选为 < 10 nM，和最优选为< 100 pM -约I pM时(如通过测定例如放射配体结合测定或本领 域技术人员已知的类似测定所测量)，本发明的抗体被认为特异性地结合至ro-Li表位。
[0058] 可将本发明的ro-Li蛋白或其衍生物、片段、类似物、同系物或直系同源物用作抗 体(其免疫上特异性结合这些蛋白组分)的产生中的免疫源。可将与脂蛋白体偶联的ro-Li 蛋白或其衍生物、片段、类似物、同系物或直系同源物用作抗体(其免疫上特异性结合这些 蛋白组分）的产生中的免疫源。
[0059] 本领域技术人员将认识到，通过弄清是否一种人单克隆抗体阻止本发明的人单克 隆抗体结合至ro-Li，有可能确定(不需要过度的实验)是否前者具有与后者一样的特异性。 如果所述受测试的人单克隆抗体与本发明的人单克隆抗体竞争(如通过由本发明的人单克 隆抗体产生的结合中的减少所示)，那么有可能两种单克隆抗体结合至相同的或密切相关 的表位。
[0060] 确定是否一种人单克隆抗体具有本发明的人单克隆抗体的特异性的另一方法是 将本发明的人单克隆抗体与ro-Li蛋白（它通常是与ro-Li蛋白有反应的）预孵育，并随后 加入受测试的人单克隆抗体以确定是否受测试的人单克隆抗体在其结合ro-Li的能力上 被抑制。如果所述受测试的人单克隆抗体被抑制，那么很有可能，它具有与本发明的单克隆 抗体相同或功能上同等的表位特异性。本发明的人单克隆抗体的筛选还可通过使用ro-Li 并确定是否该测试单克隆抗体能够中和I3D-Ll而实施。
[0061] 本领域内已知的多种方法可用于制备定向抗本发明的蛋白或抗其衍生物、片 段、类似物、同系物或直系同源物的多克隆或单克隆抗体。（参见，例如，Antibody :A Laboratory Manual (抗体：实验室手册），Harlow E, and Lane D, 1988，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY,通过引用并入本文）。
[0062] 抗体可通过周知的技术，例如使用蛋白A或蛋白G的亲和层析(其主要提供免疫血 清的IgG流分）纯化。随后或备选地，可将特异性抗原(其为寻求的免疫球蛋白的靶）或其 表位固定在柱上以通过免疫亲和层析而纯化免疫特异性抗体。免疫球蛋白的纯化例如由D. Wilkinson论述（The Scientist,由 The Scientist, Inc. , Philadelphia PA, Vol. 14, No. 8 (2000 年 4 月 17 日），25-28 页公布）。
[0063] 本文使用的术语〃单克隆抗体〃或"Mb"或〃单克隆抗体组合物〃是指含有仅一 种分子种类的抗体分子的抗体分子群体，所述抗体分子由独特的轻链基因产物和独特的重 链基因产物组成。尤其地，单克隆抗体的互补决定区（CDR)在该群体的所有分子中为一致 的。Mb含有能够与特定抗原表位免疫反应的抗原结合位点(其表征为对抗原表位独特的结 合亲和性)。
[0064] 单克隆抗体可使用杂交瘤法，例如由Kohler和Milstein, Nature, 256:495 (1975)描述的那些杂交瘤法而制备。在杂交瘤法中，通常将小鼠、仓鼠或其它合适的宿主动 物用免疫剂免疫以引出产生或能够产生抗体的淋巴细胞，所述抗体与免疫剂特异性结合。 备选地，淋巴细胞可在体外被免疫。
[0065] 免疫剂通常包括蛋白抗原、其片段或其融合蛋白。通常，如果需要人源细胞则使 用外周血淋巴细胞，或如果需要非人哺乳动物源则使用脾细胞或淋巴结细胞。随后使用合 适的融合剂，例如聚乙二醇将淋巴细胞与永生化的细胞系融合以形成杂交瘤细胞（Goding， Monoclonal Antibodies： principles and Practice(单克降抗体：原理和实施)，Academic Press，（1986年）59-103页）。永生化的细胞系通常为转化的哺乳动物细胞，特别是啮 齿动物、牛和人源的骨髓瘤细胞。通常，使用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。可将杂交瘤细胞在 合适的培养基中培养，所述培养基优选含有一种或多种抑制未融合的永生化细胞的生长或 存活的物质。例如，如果亲本细胞缺乏酶--次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（HGPRT或 HPRT)，则杂交瘤的培养基通常包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷（"HAT培养基〃），所述物质 防止HGPRT-缺陷型细胞的生长。
[0066] 优选的永生化的细胞系是有效地融合、支持由选定的抗体产生细胞产生的抗体 的稳定高水平表达和对诸如HAT培养基等培养基敏感的那些细胞系。更优选的永生化的 细胞系为鼠骨髓瘤系，其可例如从Salk Institute cell Distribution Center,圣地亚 哥，加利福利亚和American Type Culture Collection,马纳萨斯，维吉尼亚获得。人骨 髓瘤和小鼠-人杂骨髓瘤细胞系也已被描述用于人单克隆抗体的产生。（参见Kozbor， J. Immunol·, 133:3001 (1984); Brodeur 等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications (单克隆抗体的产生技术和应用)，Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) 51-63 页））。
[0067] 杂交瘤细胞在其中培养的培养基可随后针对定向抗抗原的单克隆抗体的存在而 测定。优选地，由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或通过体外结 合测定，例如放射免疫测定（RIA)或酶联免疫吸附测定（ELISA)而确定。这类技术和测定 在本领域中是已知的。单克隆抗体的结合亲和力可例如通过Munson和Pollard, Anal. Biochem.，107:220 (1980)的Scatchard分析而确定。此外，在单克隆抗体的治疗应用中， 重要的是鉴定出对靶抗原具有高度特异性和高结合亲和力的抗体。
[0068] 在所需杂交瘤细胞被鉴定出之后，可通过有限稀释步骤将克隆亚克隆并通过标 准方法让其生长。（参见Goding, 单克降抗.体：原理和实施（Monoclonal Antibodies： principles and Practice) . Academic Press, (1986) 59-103 页）。为此目的的合适的 培养基包括，例如，Dulbecco's Modified Eagle's Medium 和 RPMI-1640 培养基。备选地， 可让杂交瘤细胞作为哺乳动物的腹水在体内生长。
[0069] 由亚克隆分泌的单克隆抗体可通过常规免疫球蛋白纯化方法例如，A蛋白琼脂糖、 羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析从培养基或腹水流体中分离或纯化。
[0070] 单克隆抗体也可通过重组DNA法(例如在美国专利号4, 816, 567中描述的那些)而 进行。编码本发明的单克隆抗体的DNA可容易地使用常规方法（例如，通过使用能够特异 性地结合至编码鼠抗体的重链和轻链的基因的寡聚核苷酸探针）分离并测序。本发明的杂 交瘤细胞作为这类DNA的优选来源。一旦被分离出来，该DNA就可被放入表达载体，其随后 被转染入宿主细胞例如猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢（CHO)细胞或骨髓瘤细胞(其不另外产 生免疫球蛋白），以获得在重组宿主细胞中的单克隆抗体的合成。DNA也可例如，通过用人重 链和轻链恒定结构域的编码序列代替同源鼠序列（参见美国专利号4, 816, 567; Morrison， Nature 368，812-13(1994))或通过将非免疫球蛋白多肽的编码序列的全部或一部分共价 连接至免疫球蛋白编码序列而修饰。这类非免疫球蛋白多肽可取代本发明的抗体的恒定结 构域，或可取代本发明的抗体的抗原-结合位点的可变结构域，以产生嵌合二价抗体。
[0071] 全人抗体是抗体分子，其中轻链和重链二者的整个序列(包含⑶R)由人基因产生。 本文中这类抗体被称为"人源化抗体"、"人抗体"或"全人抗体"。人单克隆抗体可通过使用 三源杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术（参见Kozbor等人，1983 Immunol Today 4: 72) 和用以制备人单克隆抗体的EBV杂交瘤技术（参见Cole等人，1985 In:单克隆抗体和癌 治疗（Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy) , Alan R. Liss, Inc.，77-96 页） 而制备。人单克隆抗体通过使用人杂交瘤（参见Cote等人，1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030)或通过在体外用Epstein Barr病毒转化人B细胞（参见Cole等人， 198