与igf1r结合的抗原结合蛋白的制作方法
【技术领域】
[0001] 本公开提供了涉及或源自抗IGFlR抗体的组合物及方法。更具体地来说，本公开 提供了与IGFlR结合的人抗体、能够结合IGFlR的所述抗体片段及衍生物、包含所述片段的 IGFlR结合性多肽。进一步而言，本公开提供了编码所述抗体、抗体片段和衍生物及多肽的 核酸，包含所述多肽的细胞，用于制备所述抗体、抗体的片段和衍生物及多肽的方法，以及 使用所述抗体、所述抗体片段及其衍生物和多肽的方法，包括治疗或诊断患有IGFlR相关 疾病或症状的对象，包括各种炎性疾病和各种癌症。
【背景技术】
[0002] 类胰岛素生长因子，亦称为生长调节素，包括类胰岛素生长因子I (IGF-I)和 类胰岛素生长因子 II(IGF-II)(Klapper，et al·，（1983)Endocrinol. 112:2215and Rinderknecht，et al. ,(1978)Febs. Lett. 89:283)。所述生长因子通过与称为类膜岛 素生长因子受体I(IGFlR)的共同受体相结合（Sepp-Lorenzino, (1998)Breast Cancer Research and Treatment 47:235)，对各种类型细胞具有促有丝分裂活性，包括肿瘤细胞 (Macaulay, (1992)fc.J. Cancer 65:311)。IGFs与IGFlR的相互作用，通过触发受体酪氨酸 残基的自磷酸化，激活受体 residues (Butler, et al·，（1998) Comparative Biochemistry and Physiology 121:19)。IGFlR-旦被激活，便磷酸化胞内目标，以激活细胞信号通路。 该受体激活是刺激肿瘤细胞生长和生存的关键。因此，抑制IGFlR活性是一种治疗或预防 人癌症和其他增值性疾病的宝贵潜在方法。
[0003] 数种证据表明，IGF-I、IGF-II及其受体IGFlR是恶性表型的重要介导。IGF-I血 衆水平据发现是前列腺癌风险的最佳指标（Chan, et al.，（1998)Science 279:563)，还有 类似的流行病学研宄有力地将血浆IGF-I水平与乳腺癌、结肠癌和肺癌风险联系在一起。
[0004] 类胰岛素生长因子受体1的过度表达也被发现存在于数种癌细胞系和肿瘤组 织中。IGFlR在40%所有乳腺癌细胞系中过度表达（Pandini，etal.，（1999)Cancer Res.5:1935)，且在15%肺癌细胞系中过度表达。与正常组织相比，乳腺癌肿瘤组织中， IGFlR过度表达6-14倍，且IGFlR表现出高2-4倍的激酶活性（Webster, et al.，（1996) Cancer Res. 56:2781and Pekonen, et al. , (1998)Cancer Res. 48:1343) 〇 90%的结肠直 肠癌组织切片表现出IGFlR水平的提高，其中IGFlR表达程度与疾病严重程度相关。与正 常的子宫颈阴道部细胞相比，原代宫颈癌细胞培养物和宫颈癌细胞系的分析，分别显示出3 倍和 5倍过度表达（Steller, et al.，（1996) Cancer Res. 56:1762)。IGFlR在滑膜肉瘤细胞 中的表达也与侵袭性表型（即迀移和高增殖率，Xie，et al.，（1999) Cancer Res. 59:3588) 相关。此外，肢端肥大症，一种慢性发展疾病，是生长荷尔蒙和IGF-I过度分泌造成的 (Ben_Schlomo，et al·，（2001)Endocrin. Metab. Clin. North. Am. 30:565-583)。对 IGFlR功 能的拮抗可能有助于治疗该疾病。本领域中仍存在对IGFlR拮抗剂疗法的需要，用于治疗 或预防所述疾病和紊乱，尤其有用的是基于抗IGFlR抗体的疗法。
【发明内容】
[0005] 本公开提供一种与IGFlR表位结合且结合亲和性至少为KT6M的IgG类全人抗体， 其重链可变域序列与选自下列的氨基酸序列至少95%相同：SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 3、 SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 13、SEQ ID NO. 15、 SEQ ID NO. 17,SEQ ID NO. 19,SEQ ID NO. 2USEQ ID NO. 23,SEQ ID NO. 25,SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 29、SEQ ID NO. 31，及其组合；其轻链可变域序列与选自下列的氨基酸序列至少 95%相同：SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO. 16、SEQ ID NO. 18、SEQ ID NO. 20、SEQ ID NO. 22、SEQ ID NO. 24、SEQ ID NO. 26、SEQ ID NO. 28、SEQ ID NO. 30、SEQ ID NO. 32,及其组合。优选地， 该全人抗体具有重链和轻链，其中该抗体的重链/轻链可变域序列选自下列序列：SEQ ID NO. 1/SEQ ID NO. 2 (本文称为 GFAl)、SEQ ID NO. 3/SEQ ID NO. 4 (本文称为 GFA3)、SEQ ID NO. 5/SEQ ID NO. 6 (本文称为 GFA5)、SEQ ID NO. 7/SEQ ID NO. 8 (本文称为 GFA6)、SEQ ID N0.9/SEQ ID Ν0·10(本文称为GFA12)、SEQ ID NO.ll/SEQ ID Ν0·12(本文称为GFC2)、SEQ IDN0·13/SEQIDN0·14(本文称为A2)、SEQIDN0·15/SEQIDN0·16(本文称为A11)、SEQ ID NO. 17/SEQ ID NO. 18(本文称为 B9)、SEQ ID NO. 19/SEQ ID Ν0·20(本文称为 B10)、SEQ ID NO. 21/SEQ ID NO. 22 (本文称为 A6)、SEQ ID NO. 23/SEQ ID NO. 24 (本文称为 C8)、SEQ ID NO. 25/SEQ ID NO. 26 (本文称为 C4)、SEQ ID NO. 27/SEQ ID NO. 28 (本文称为 E2)、SEQ ID NO. 29/SEQ ID NO. 30 (本文称为 B3)、SEQ ID NO. 31/SEQ ID NO. 32 (本文称为 D12)，及 其组合。
[0006] 本公开提供一个全人Fab抗体片段，其具有来自重链的可变域和来自轻链的可变 域，其中，重链可变域序列与选自下列的氨基酸序列及至少95%相同：SEQ ID NO. USEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 13、SEQ ID NO. 15,SEQ ID NO. 17,SEQ ID NO. 19,SEQ ID NO. 2USEQ ID NO. 23,SEQ ID NO. 25,SEQ ID NO. 27、SEQ ID NO. 29、SEQ ID NO. 31，及其组合；且其轻链可变域序列与选自下列的氨基酸 序列至少95%相同：SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.8、SEQ ID NO. 10、 SEQ ID NO. 12,SEQ ID NO. 14,SEQ ID NO. 16,SEQ ID NO. 18,SEQ ID NO. 20,SEQ ID NO. 22, SEQ ID NO. 24、SEQ ID NO. 26、SEQ ID NO. 28、SEQ ID NO. 30、SEQ ID NO. 32,及其组合；优 选地，该全人抗体Fab片段具有重链可变域和轻链可变域，其中该抗体的重链/轻链可变域 序列选自下列序列：SEQ ID NO. 1/SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3/SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5/ SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7/SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9/SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11/SEQ ID NO. 12,SEQ ID NO. 13/SEQ ID NO. 14,SEQ ID NO. 15/SEQ ID NO. 16,SEQ ID NO. 17/SEQ ID NO. 18,SEQ ID NO. 19/SEQ ID NO. 20,SEQ ID NO. 21/SEQ ID NO. 22,SEQ ID NO. 23/SEQ ID NO. 24,SEQ ID NO. 25/SEQ ID NO. 26,SEQ ID NO. 27/SEQ ID NO. 28,SEQ ID NO. 29/SEQ ID NO. 30、SEQ ID NO. 31/SEQ ID NO. 32,及其组合。
[0007] 本公开提供一个单链人抗体，其具有来自重链的可变域、来自轻链的可变域、连接 重链和轻链可变域的连接肽，其中，重链可变域序列与选自下列的氨基酸序列至少95%相 同：SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 11、 SEQ ID NO. 13,SEQ ID NO. 15,SEQ ID NO. 17,SEQ ID NO. 19,SEQ ID NO. 2USEQ ID NO. 23, SEQIDN0·25、SEQIDN0·27、SEQIDN0·29、SEQIDN0·31，及其组合；其轻链可变域序列 与选自下列的氨基酸序列至少95%相同：SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO. 16、SEQ ID NO. 18、SEQ ID NO. 20,SEQ ID NO. 22,SEQ ID NO. 24,SEQ ID NO. 26,SEQ ID NO. 28,SEQ ID NO. 30,SEQ ID NO. 32,及其组合。优选地，该全人单链抗体具有重链可变域和轻链可变域，其中该抗单链全 人抗体的重链/轻链可变域序列选自下列序列：SEQ ID NO. 1/SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3/ SEQ ID NO. 4,SEQ ID NO. 5/SEQ ID NO. 6,SEQ ID NO. 7/SEQ ID NO. 8,SEQ ID NO. 9/SEQ ID NO. 10,SEQ ID NO. 11/SEQ ID NO. 12,SEQ ID NO. 13/SEQ ID NO. 14,SEQ ID NO. 15/SEQ ID NO. 16,SEQ ID NO. 17/SEQ ID NO. 18,SEQ ID NO. 19/SEQ ID NO. 20,SEQ ID NO. 21/SEQ ID NO. 22,SEQ ID NO. 23/SEQ ID NO. 24,SEQ ID NO. 25/SEQ ID NO. 26,SEQ ID NO. 27/SEQ ID N0·28、SEQIDN0·29/SEQIDN0·30、SEQIDN0·31/SEQIDN0·32，及其组合。
[0008] 本公开进一步提供一种治疗广谱哺乳动物癌症或广谱炎性疾病和自体免疫疾病 的方法，包括以抗IGFlR多肽的有效剂量给药，其中所述抗IGFlR多肽选自：一种与IGFlR 表位结合且结合亲和度为至少KT6M的IgG类全人抗体、具有重链可变域和轻链可变域的全 人Fab抗体片段、具有来自重链的可变域和来自轻链的可变域以及连接所述轻链和重链可 变域的连接肽的单链人抗体，及其组合；
[0009] 其中，所述全人抗体的重链可变域序列与选自下列的氨基酸序列至少95%相同： SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 13、SEQ ID NO. 15、SEQ ID NO. 17、SEQ ID NO. 19、SEQ ID NO. 21、SEQ ID NO. 23、SEQ ID NO. 25、SEQ ID NO. 27、SEQ ID NO. 29、SEQ ID NO. 31及其组合；且其轻链可变域序列与 选自下列的氨基酸序列至少95%相同：SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO. 16、SEQ ID NO. 18、SEQ ID NO. 20,SEQ ID NO. 22,SEQ ID NO. 24,SEQ ID NO. 26,SEQ ID NO. 28,SEQ ID NO. 30,SEQ ID NO. 32,及其组合；
[0010] 其中，所述全人抗体Fab片段的重链可变域序列与选自下列的氨基酸序列至少 95%相同：SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. IUSEQ ID NO. 13,SEQ ID NO. 15,SEQ ID NO. 17,SEQ ID NO. 19,SEQ ID NO. 2USEQ ID NO. 23、SEQ ID NO. 25、SEQ ID NO. 27、SEQ ID NO. 29、SEQ ID NO. 31，及其组合；且其轻链 可变域序列与选自下列的氨基酸序列至少95%相同：SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO. 16、SEQ ID NO. 18,SEQ ID NO. 20,SEQ ID NO. 22,SEQ ID NO. 24,SEQ ID NO. 26,SEQ ID NO. 28,SEQ ID NO. 30,及其组合；以及
[0011] 其中，所述单链人抗体的重链可变域序列与选自下列的氨基酸序列至少95%相 同：SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 11、 SEQ ID NO. 13,SEQ ID NO. 15,SEQ ID NO. 17,SEQ ID NO. 19,SEQ ID NO. 2USEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 25、SEQ ID NO. 27、SEQ ID NO. 29、SEQ ID NO. 31，及其组合；且其轻链可变域序 列与选自下列的氨基酸序列至少95%相同：SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. KKSEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO. 16、SEQ ID NO. 18、SEQ ID NO. 20,SEQ ID NO. 22,SEQ ID NO. 24,SEQ ID NO. 26,SEQ ID NO. 28,SEQ ID NO. 30,SEQ ID NO. 32,及其组合。
[0012] 优选地，所述全人抗体具有重链和轻链，其中所述抗体的重链/轻链可变域序列 选自以下序列：SEQ ID NO. 1/SEQ ID NO. 2(本文称为GFA1)、SEQ ID NO. 3/SEQ ID NO. 4(本 文称为 GFA3)、SEQ ID NO. 5/SEQ ID NO. 6(本文称为 GFA5)、SEQ ID NO. 7/SEQ ID NO. 8(本文 称为GFA6)、SEQ ID N0.9/SEQ ID NCX 10(本文称为GFA12)、SEQ ID NO. 11/SEQ ID NO. 12(本 文称为 GFC2)、SEQ ID NO. 13/SEQ ID NO. 14(本文称为A2)、SEQ ID NO. 15/SEQ ID NO. 16(本 文称为A11)、SEQIDN0·17/SEQIDN0·18(本文称为B9)、SEQIDN0·19/SEQIDN0·20(本 文称为B10)、SEQ ID N0.21/SEQ ID Ν0·22(本文称为A6)、SEQ ID N0.23/SEQ ID Ν0·24(本 文称为 C8)、SEQ ID N0.25/SEQ ID Ν0·26(本文称为 C4)、SEQ ID N0.27/SEQ ID Ν0·28(本 文称为 E2)、SEQ ID N0.29/SEQ ID Ν0·30(本文称为 B3)、SEQ ID N0.31/SEQ ID Ν0·32(本 文称为D12)，及其组合；优选地，所述全人抗体Fab片段具有重链可变域和轻链可变域，其 中所述抗体的重链/轻链可变域序列选自下列序列：SEQ ID NO. 1/SEQ ID NO. 2 (本文称为 GFA1)、SEQ ID N0.3/SEQ ID Ν0·4(本文称为 GFA3)、SEQ ID N0.5/SEQ ID Ν0·6(本文称为 GFA5)、SEQ ID N0.7/SEQ ID Ν0·8(本文称为 GFA6)、SEQ ID N0.9/SEQ ID Ν0·10(本文称为 GFA12)、SEQ ID NO. 11/SEQ ID NO. 12(本文称为GFC2)、SEQ ID NO. 13/SEQ ID NO. 14(本文 称为A2)、SEQIDN0·15/SEQIDN0·16(本文称为A11)、SEQIDN0·17/SEQIDN0·18(本文 称为 B9)、SEQ ID NO. 19/SEQ ID NO. 20 (本文称为 B10)、SEQ ID NO. 21/SEQ ID NO. 22 (本 文称为 A6)、SEQ ID N0.23/SEQ ID Ν0·24(本文称为 C8)、SEQ ID N0.25/SEQ ID Ν0·26(本 文称为 C4)、SEQ ID N0.27/SEQ ID Ν0·28(本文称为 E2)、SEQ ID N0.29/SEQ ID Ν0·30(本 文称为Β3)、SEQ ID NO. 31/SEQ ID NO. 32(本文称为D12)，及其组合；优选地，所述全人单 链抗体具有重链可变域和轻链可变域，其中所述单链全人抗体的重链/轻链可变域序列 选自下列序列：SEQ ID NO. 1/SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3/SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5/SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7/SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9/SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11/SEQ ID NO. 12,SEQ ID NO. 13/SEQ ID NO. 14,SEQ ID NO. 15/SEQ ID NO. 16,SEQ ID NO. 17/SEQ ID NO. 18,SEQ ID NO. 19/SEQ ID NO. 20,SEQ ID NO. 21/SEQ ID NO. 22,SEQ ID NO. 23/SEQ ID NO. 24,SEQ ID NO. 25/SEQ ID NO. 26,SEQ ID NO. 27/SEQ ID NO. 28,SEQ ID NO. 29/SEQ ID NO. 30、SEQ ID NO. 31/SEQ ID NO. 32,及其组合。
[0013] 优选地，待治疗的广谱哺乳动物癌症选自骨肉瘤、横纹肌肉瘤、神经母细胞瘤、任 何儿科癌、肾癌、白血病、肾移行细胞癌、沃纳-莫里森（Werner-Morrison)综合征、膀胱癌、 肾母细胞癌、卵巢癌、胰腺癌、良性前列腺增生、乳腺癌、前列腺癌、骨癌、肺癌、胃癌、结肠直 肠癌、子宫颈癌、滑膜肉瘤、转移性类癌相关性腹泻、血管活性肠肽分泌肿瘤、头颈部癌、鳞 状细胞癌、多发性骨髓瘤、孤立性浆细胞瘤、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、生殖细胞肿瘤、肝 母细胞瘤、肝细胞癌、黑素瘤、肾横纹肌样瘤、尤因肉瘤（Ewing Sarcoma)、软骨肉瘤、血液恶 性肿瘤、慢性成淋巴细胞白血病、慢性骨髓单核细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、 急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、急性粒细胞白血病、慢性成髓细胞性白血病、 霍奇金（Hodgekin)氏病、非霍奇金（Hodgekin)氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓 性白血病、骨髓增生异常综合征、毛细胞白血病、肥大细胞白血病、肥大细胞瘤、滤泡性淋巴 瘤、弥漫性大细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、伯基特（Burkitt)淋巴瘤、蕈样真菌病、西扎里 (Seary)综合征、皮肤T细胞淋巴瘤、慢性骨髓增殖性疾病、中枢神经系统肿瘤、脑癌、成胶 质细胞瘤、非成胶质细胞瘤脑癌、脑膜瘤、垂体腺瘤、前庭神经鞘瘤、原始神经外胚层瘤、髓 母细胞瘤、星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、室管膜瘤和脉络丛乳头状瘤、 骨髓增生性障碍、真性红细胞增多症、血小板增多症、特发性骨髓纤维化、软组织肉瘤、甲状 腺癌、子宫内膜癌、类癌肿瘤、生殖细胞肿瘤、肝癌，及其组合。
【附图说明】
[0014] 图1展示了以两种方法测定的抗IGFlR抗体C2亲和性。感应器上涂覆了 rhIGFIR 或C2IgG之一，然后与其中另外一种共同培养，并以Forte Bio Octet Red装置测定亲和性。 两种方法测出的C2亲和性为5. 38nM或I. 45nM。
[0015] 图2展示了以Forte Bio Octet Red装置测定抗IGFlR抗体对抗hlgG Fe捕获传 感器的亲和性。B9的亲和性测定为I. 25nM。
[0016] 图3展示了抗IGFlR抗体与MCF7细胞的细胞结合度和EC50值。
[0017] 图4战士了对比抗IGFlR抗体与IGFlR和与胰岛素受体结合的ELISA实验结果。 克隆B9、BlO和C8并不与胰岛素受体交叉反应。
[0018] 图5展示了 MCF7乳腺癌细胞中IGFl刺激的IGFlR自磷酸化。比较浓度为10 μ g/ ml的各种抗IGFlR抗体，克隆A6、B9、B10、B10VAR、C2和C8展现出最大的拮抗作用。
[0019] 图6展示了抗IGFlR抗体克隆A6、B9、B10VAR、C2和C8对MCF7乳腺癌细胞中的 IGFl刺激的IGFlR自磷酸化的抑制作用的IC5(I。B9展示了 IGFlR自磷酸化的出众拮抗作 用，其 IC5tl为 94pM。
[0020] 图7展示了抗IGFlR抗体对MCF7细胞中IGFl刺激的增殖的抑制作用。与未用抗 体处理的细胞相比，抗IGFlR抗体克隆C2、BlOVAR和C8展现出对IGFl刺激的增殖的强烈 剂量依赖性拮抗作用
[0021] 图8显示，以100ng/ml IGF2处理MCF7细胞，显现出IGFlR的强力激活磷酸化（第 2栏"仅IGF2"与第1栏"未处理"相比较）。以抗IGFlR抗体抗体预处理细胞在不同程度 上阻断了对IGFlR的此种激活。克隆BlO展示出对IGFlR自磷酸化的最强力拮抗作用。数 据显示为三联样本的540nm吸光度（ABS 450nm) 土标准误差，且直接与IGFlR磷酸化/激 活成正比。
【具体实施方式】
[0022] 本公开提供一个与IGFlR表位结合且结合亲和性为KT6M或以下的IgG类全人抗 体，其重链可变域序列与选自下列的氨基酸序列至少95%相同：ID NO. 1、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 5,SEQ ID NO. 7,SEQ ID NO. 9,SEQ ID NO. IUSEQ ID NO. 13,SEQ ID NO. 15,SEQ ID NO. 17,SEQ ID NO. 19,SEQ ID NO. 2USEQ ID NO. 23,SEQ ID NO. 25,SEQ ID NO. 27,SEQ ID NO. 29、SEQ ID NO. 31，及其组合；其轻链可变域序列与选自下列的氨基酸序列及其组合至 少95%相同：SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.8、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO. 16