用于诊断和治疗钩端螺旋体病的方法和蛋白质抗原组合物的制作方法

用于诊断和治疗钩端螺旋体病的方法和蛋白质抗原组合物的制作方法
【专利说明】
[0001] 本申请要求于2012年12月12日提交的临时申请号61/736391的优先权。这些 和所有其它引用的外来材料的全部内容均以引用方式并入本文中。当以引用方式并入的参 考文献中的术语的定义或使用与本文提供的术语的定义不一致或相反时，以本文提供的该 术语的定义为准。
技术领域
[0002] 本发明的领域是用于诊断和治疗各种病症和疾病、特别是钩端螺旋体病的组合物 和方法。
【背景技术】
[0003] 钩端螺旋体病是由感染钩端螺旋体属（Leptospira)细菌而引起的广泛的重大疾 病。所述疾病由于人与受感染的家养动物或野生动物接触或通过与它们的尿液接触而传播 给人。众多种动物物种可充当所述细菌的储库。因此，人钩端螺旋体病经常被认为是最广泛 的动物传染性疾病。传统处于患钩端螺旋体病的高风险的群体包括农夫、兽医、军事人员、 矿工和处理污水的个体。然而，也已经观察到不同的传播模式。已经将钩端螺旋体病的爆 发与例如强调户外活动的生态旅游和体育赛事的娱乐活动关联。
[0004] 患有钩端螺旋体病的个体在所述疾病的早期阶段显示众多种相对非特异性的临 床症状，包括发热、头痛、发冷和严重的肌肉疼痛，使得基于临床发现的早期诊断变得困难。 遗憾的是，5-15%的感染导致严重的多系统并发症，包括黄疸、肾衰竭和出血。严重的钩端 螺旋体病具有5-40%的死亡率。与严重贫困相关的状况已导致钩端螺旋体病在巴西和其它 国家市区的流彳丁，且具有尚死亡率。
[0005] 不仅对于评估疾病的全球负担，而且对于提供早期诊断来说，缺乏快速且可靠的 现场护理（point-of-care)诊断测试都是主要障碍。当前的诊断测试主要依赖于结合钩端 螺旋体脂多糖（LPS)的抗体的检测并且对于抗生素疗法最有效的早期疾病是不灵敏的。
[0006] 特别是在疾病的早期可治疗时期，钩端螺旋体病的诊断是困难的。目前，存在钩端 螺旋体属的最直接证明是通过分离和培养或PCR。遗憾的是，细菌学分离是昂贵的过程，需 要训练有素的技术人员和专门的设施。在钩端螺旋体病的情况下，钩端螺旋体属的敏感特 性使这进一步复杂化，其需要使用非常新鲜的样品。另外，所述生物体在培养中生长相对缓 慢，得出结果需要数周。因此，PCR被证明是用于在样品中鉴别钩端螺旋体属的更有用工具。 然而，PCR方法仍然需要专门的设备和高技术水平来恰当地进行，并且尽管是灵敏的，但可 能不足以定量评估钩端螺旋体属感染的时期。
[0007] 钩端螺旋体病还可以使用表征个体对所述生物体的免疫反应的血清学方法来诊 断。目前用于钩端螺旋体病的血清学诊断的参考方法是微量凝集测试（MAT)，其中对患者血 清凝集培养的钩端螺旋体属的能力进行表征。遗憾的是，这种方法受限于需要培养用于测 定的钩端螺旋体属和所述生物体的异质性。
[0008] 已进行尝试来鉴别和产生特定的钩端螺旋体属蛋白质或肽，其可用于诊断钩 端螺旋体病的传统免疫测定（例如酶免疫测定或侧向流测试）。例如，在欧洲专利号 2205625B1 (授予Chang)和美国专利申请号2012/0100143(授予Chang)中，公开了许多 用于诊断和预防钩端螺旋体病的钩端螺旋体属外膜蛋白（即LP 1454、LP 1118、LP 1939、 MCEII、CADF-likel、CADF-like2、CADF-like3、Lp0022、Lpl499、Lp4337、Lp328、L21)和表面 蛋白（即LigA和LigB)。类似地，美国专利号7, 531，177 (授予Nascimento等人）描述了使 用表面相关蛋白质 LpL53、0MPL55、0MPL16、0MPL31、OMPLl5、0MPL20、LpL23、LpL22、OMPLl7、 0MPL30、0MPL27、0MPL21、0MPL22、MPL17、MPL21、0MPAL21、0MPL63、0MPL14、MPL36、MPL39、 MPL40和MPL21作为用作免疫接种物质以及用于钩端螺旋体属的免疫学测定的抗原。然而， 以所述方法预选潜在抗原将它们限定为钩端螺旋体属表面蛋白质，所述蛋白质虽然可被个 体的免疫系统获取，但可能不包括可用的靶标。
[0009] 其它研宄人员已使用各种方法从更多种类的蛋白质鉴别潜在的钩端螺旋体属抗 原。例如，美国专利号7, 635,480(授予Andre-Fontaine等人）公开了使用通过用来自钩 端螺旋体属的致病菌株的全细胞进行免疫而产生的血清标记来自致病菌株和非致病菌株 的蛋白质；随后在由此标记的蛋白质之间进行区别使得鉴别出可用于预防和鉴别钩端螺旋 体病的肽。在美国专利号8, 445, 658(授予Ko等人）中描述的另一种方法中，研发出钩端 螺旋体属基因组的噬菌体文库并且使用来自康复的钩端螺旋体病患者的免疫血清来选择 具有已诱发免疫反应的蛋白质的克隆。鉴别了数种先前未鉴别出的蛋白质抗原（即BigLU BigL2和BigL3)，以及许多先前已知的钩端螺旋体属抗原。虽然所述方法减少了通过特定 类别的蛋白的预选所引入的偏差，但它们仅仅鉴别了已诱发抗体的蛋白质和/或蛋白质片 段。然而，所述方法未能特异性地鉴别和提供可用于诊断性和预防性目的、产生特别强的和 /或广泛的抗体反应的钩端螺旋体属抗原。
[0010] 本文所标识的所有出版物均在此以引用方式并入，其并入程度如同具体地且单独 地指示将每一单独的出版物或专利申请以引用方式并入一般。当所并入的参考文献中的术 语的定义或使用与本文提供的该术语的定义不一致或相反时，适用本文提供的该术语的定 义，而不适用参考文献中的该术语的定义。
[0011] 因此，仍然需要可用于通过免疫学方法诊断钩端螺旋体病和/或可用于生产预防 性和治疗性疫苗的免疫显性钩端螺旋体属抗原。

【发明内容】

[0012] 本发明主题提供用于诊断、预防和治疗钩端螺旋体病的设备、系统和方法。在一个 方面，包含问号钩端螺旋体（Leptospira interrogans)的天然和重组多肽的组合物可用 于患者诊断。在另一方面，包含问号钩端螺旋体的天然和/或重组多肽的组合物可用作预 防性和/或治疗性疫苗。还涵盖用于选择抗原的富集分析方法、用于鉴别血清学诊断抗原 或疫苗抗原的方法以及用于产生诊断测定的方法，所述诊断测定用于针对所述蛋白质的抗 体。
[0013] 本发明主题的一个实施方案是包含两种或更多种与载体缔合的抗体反应性抗原 的抗原组合物。所述抗原与从来自暴露于钩端螺旋体病或以其它方式感染钩端螺旋体病的 群体的血清获得的抗体具有已知的、定量的和/或以其它方式表征的反应性（例如相互作 用强度）。在一些所述实施方案中，此类抗原的已知抗体反应性平均处于由钩端螺旋体病 患者产生的抗体的结合亲和力的较高三分位组（upper tertile)中。类似地，在本发明构 思的其它此类实施方案中，钩端螺旋体病患者中产生的并且针对一种或多种此类抗原的抗 体的平均数量处于所述较高三分位组中。类似地，在其它此类实施方案中，反应性以钩端螺 旋体病感染的活性状态为特征。至少两种所述抗原具有已知的与疾病参数的关联，所述疾 病参数例如先前或目前对钩端螺旋体病的暴露、急性钩端螺旋体病感染、潜伏性钩端螺旋 体病感染、复发性钩端螺旋体病感染、钩端螺旋体病病原携带状态（carrier state)和对 钩端螺旋体病感染的至少部分免疫性。合适的抗原包括LIC11352、LIC12544、LIC12631、 LIC10464-sl、LIC11335、LIC20301、LIC10486、LIC10191、LIC11389、LIC11437、LIC20087、 LIC10623、LIC10998、LIC10215、LIC11271、LIC10491-sl、LIC13050、LIC11210、LIC10524、 LIC11456、LIC12476、LIC11570、LIC13244、LIC13238、LIC11885、LIC11008、LIC13242、 LIC11336、LIC20250、LIC10525、LIC10464-S2. 1、LIC20118、CopLigAU(独特的）：重复 A7' -13、CopLigBU(独特的）：重复 B7' -12 和 CopLigB:重复 1-16、ntl54-173(核苷酸 154-173)或其片段。此类抗原或其片段可作为纯化的或至少部分纯化的蛋白质或肽（例如 具有大于60%的纯度）提供。所述组合物的至少两种所述抗原可存在于至少40%的暴露 于钩端螺旋体病的群体中。在本发明构思的一些实施方案，抗原组合物的载体是例如用于 疫苗（例如，治疗性疫苗）制剂中药物载体。在替代实施方案中，载体是至少两种所述抗原 在其上可彼此区别的不溶性载体。此类不溶性载体可用于诊断测定，并且包括固体载体和 可悬浮粒子，在所述固体载体中，抗原被布置在单独的且可区别的位置（例如，在阵列中） 处，在所述可悬浮粒子中，抗原被布置在不同的且可区别的粒子群上。
[0014] 本发明主题的另一实施方案是用于诊断哺乳动物中的钩端螺旋体病的抗原组合 物，其包括两种或更多种与载体缔合的抗体反应性抗原。所述抗原与从来自暴露于钩端螺 旋体病或以其它方式感染钩端螺旋体病的群体的血清获得的抗体具有已知的、定量的和/ 或以其它方式表征的反应性（例如相互作用强度）。在一些所述实施方案中，此类抗原的 已知抗体反应性平均处于由钩端螺旋体病患者产生的抗体的结合亲和力的较高三分位组 中。类似地，在本发明构思的其它此类实施方案中，钩端螺旋体病患者中产生的并且针对一 种或多种此类抗原的抗体的平均数量处于较高三分位组中。类似地，在其它此类实施方案 中，反应性以钩端螺旋体病感染的活性状态为特征。至少两种所述抗原具有已知的与疾病 参数的关联，所述疾病参数例如先前或目前对钩端螺旋体病的暴露、急性钩端螺旋体病感 染、潜伏性钩端螺旋体病感染、复发性钩端螺旋体病感染、钩端螺旋体病病原携带状态和对 钩端螺旋体病感染的至少部分免疫性。合适的抗原包括LIC11352、LIC12544、LIC12631、 LIC10464-sl、LIC11335、LIC20301、LIC10486、LIC10191、LIC11389、LIC11437、LIC20087、 LIC10623、LIC10998、LIC10215、LIC11271、LIC10491-sl、LIC13050、LIC11210、LIC10524、 LIC11456、LIC12476、LIC11570、LIC13244、LIC13238、LIC11885、LIC11008、LIC13242、 LIC11336、LIC20250、LIC10525、LIC10464-S2. 1、LIC20118、CopLigAU(独特的）：重复 A7' -13、CopLigBU(独特的）：重复 B7' -12 和 CopLigB:重复 1-16, ntl54-173 或其片段。 此类抗原或其片段可作为纯化的或至少部分纯化的蛋白质或肽（例如具有大于60%的纯 度）提供。所述组合物的至少两种所述抗原可存在于至少40%的暴露于钩端螺旋体病的群 体中。在一些实施方案中，载体是至少两种所述抗原在其上可彼此区别的不溶性载体。所 述不溶性载体可用于诊断测定，并且包括固体载体和可悬浮粒子，在所述固体载体中，抗原 被布置在单独的且可区别的位置（例如，在阵列中）处，在所述可悬浮粒子中，抗原被布置 在不同的且可区别的粒子群上。可选择地，在一些实施方案中，载体包括分布于基质（例 如，多孔膜或纤维片）上的可悬浮粒子，其中所述基质包括孔、间隙空间或允许流体流过所 述基质的其它开孔。
[0015] 本发明主题的又一实施方案是用作哺乳动物中的钩端螺旋体病疫苗的抗原组合 物，其中所述抗原组合物包括两种或更多种与载体缔合的抗体反应性抗原。所述抗原与 从来自暴露于钩端螺旋体病或以其它方式感染钩端螺旋体病的群体的血清获得的抗体具 有已知的、定量的和/或以其它方式表征的反应性（例如相互作用强度）。在一些此类实 施方案中，此类抗原的已知抗体反应性平均处于由