作为用于口服药物递送的载体的原生动物变体特异性表面蛋白(vsp)的制作方法
【专利说明】作为用于口服药物递送的载体的原生动物变体特异性表面 蛋白（VSP)
[0001] 对电子递交的序列表的引用
[0002] 与本申请一起提交的电子递交ASCII文本文件的序列表（文件名：3181_001PC01_ sequence_listing_ST25.txt;大小：2,8138, 935 字节；创建日期：2013年7月 1 日）的内 容通过引用并入本文。 技术背景
[0003] 本发明涉及使用多肽载体将治疗剂递送至需要该治疗剂的受试者的组合物和方 法。更具体地，本发明涉及作为用于递送治疗剂（如生物活性肽）的载体发挥作用的多肽， 如贾第虫属（Giardia sp.)可变表面蛋白（variable surface protein) (VSP)。
[0004] 由于易于施用、患者依从性和成本，口服递送代表了递送预防性和治疗性药剂的 理想手段。然而，口服途径由于胃肠道（GIT)形成的众多屏障也是最困难的。主要的挑战 是在胃和小肠上部的化学和酶降解，以及缺乏足够的穿过胃的渗透性。胃中的低PH可以使 治疗剂遭受物理和化学降解。肽的物理降解一般涉及蛋白质的原始结构到更高阶结构的修 饰，这可能是吸附、聚集、展开、沉淀和/或完全/部分降解为其氨基酸成分的结果。化学降 解通常涉及键的裂解和导致新产物的形成。
[0005] 贾第虫是能够在胃和小肠上部的恶劣环境条件下存活的肠道病原体。像许多 原生动物微生物一样，贾第虫发生抗原性变异（参见例如，Zambrano-Villa等，Trends Parasitol. 18:272-8(2002))，通过该机制它不断变换其主要的表面分子，从而允许 该寄生虫逃避宿主的免疫反应并建立慢性和/或复发性感染（参见例如，Nash，Mol. Microbiol. 45:585-90 (2002))。这些表面抗原属于变体-特异性表面蛋白（VSP)家族，其 是覆盖滋养体整个表面的膜内在蛋白。
[0006] VSP具有富含半胱氨酸的氨基末端区域以及包含跨膜区和短的胞质尾的保守 羧基末端结构域（图1A)。在贾第虫的基因组中存在大约200个VSP基因的集合，但在 任意给定时间只有一个VSP在该寄生虫的表面上表达（参见例如，Prucca等，Nature 456 (7223) : 750-4 (2008) ;Deitsch 等，Microbiol. Mol. Biol. Rev. 61:281-93 (1997)) 〇
[0007] 因为贾第虫VSP的胞外部分使得该寄生虫能够在小肠上部的敌对环境内存活， 与抗原共价结合的VSP已被用于运送（shuttle)候选抗原。已经观察到当口服施用包含 与贾第虫抗原共价结合的VSP的疫苗时，该抗原完全保护动物不受贾第虫寄生虫的后续感 染，表明该抗原在通过GIT时保存下来（Rivero等，Nat. Med. 16(5):551-7(2010),参见例 如，PCT公开号WP2010/064204和W02011/120994,其整体在此通过引用并入本文）。
[0008] 1型糖尿病通常在儿童和年轻成年人中诊断，并造成越来越大比例的国家医疗保 健支出。1型糖尿病是由免疫系统的功能障碍引起的自身免疫性疾病，它攻击并摧毁产生胰 岛素的胰岛的β-细胞。
[0009] 施用外源胰岛素是可以用来控制与该疾病并发的血糖升高的唯一药物治 疗。相反，2型糖尿病的特征是胰岛素分泌和胰岛素作用两者的缺陷，胰岛素缺乏通常 在疾病过程的后期出现。在该疾病中，经常需要补充胰岛素来实现良好的葡萄糖水平 控制（参见例如，DeWitt&Hirsch, JAMA 289:2254-2264(2003))。具有不同类型的可 用的皮下胰岛素（Summers等，Clin. Ther. 26:1498-1505(2004))。然而，调查表明部 分2型糖尿病的患者由于预期的疼痛和不方便而对胰岛素治疗具有显著阻力（Peyrot 等，Diabetes Care 28:2673-2679(2005))。最年轻的和最年长的患者最不可能接受可注 射治疗，因此对想要开始胰岛素治疗的医生提出最大的挑战（Freemantle等，Diabetes Care 28:427-428 (2005))。因此，患者的偏好驱动了开发口服、鼻用和吸入的胰岛素制 剂的努力以避免皮下注射（Cefalu, Ann. Med. 33:579-586 (2001) ;Graham等州』叩1· J. Med. 356:497-502 (2007))。因此，通过口服途径递送胰岛素的选择仍然是有吸引力的治 疗策略。
[0010] 胰高血糖素（胰腺分泌的肽激素）提高血糖水平。它的作用与降低血糖水平的胰 岛素的作用相反。胰高血糖素指示用于严重低血糖的治疗。因为1型糖尿病患者与稳定的 2型患者相比可能具有较少的血糖水平的增加，应当尽快给予补充的碳水化合物，尤其是对 儿童患者。当减少肠道蠕动是有利时，胰高血糖素还指示作为胃、十二指肠、小肠和结肠放 射学检查的辅助诊断。对于这种检查，胰高血糖素与抗胆碱能药物一样有效。然而，加入抗 胆碱能剂可能造成增加的副作用。在胰岛素的情况下，开发适合口服递送的胰高血糖素形 式是有吸引力的治疗策略。
[0011] 生长激素缺乏是涉及脑垂体腺的失调，脑垂体产生生长激素和其他激素。人生 长激素（hGH)在人体中刺激生长和细胞繁殖，也在脂质、蛋白质和碳水化合物的代谢中 发挥作用。通常通过细菌发酵生产重组的hGH(Zeisel等，!1〇1'111.1^8.37(5即？12):5-13 (1992) ;Sonoda&Sigimura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 72:2675-80 (2008))。当脑垂体 腺没有产生足够的生长激素时，生长将会比正常的慢。生长激素对于儿童的正常生长是需 要的。在成年人中，需要生长激素来维持适量的身体脂肪、肌肉和骨骼。hGH缺乏可能发生 在任何年龄。患有生长激素缺乏症的儿童和一些成年人将会受益于生长激素治疗。为了治 疗生长激素缺乏症，通常服用hGH (人生长激素）。hGH是可注射药物，其于患者皮肤的脂肪 下一周注射数次（Brearley等，BMC Clin. Pharmacol. 7:10 (2007))。在胰岛素治疗的情况 下，患者对开始注射疗法的抵抗和依从性对医生提出了挑战。因此，开发适合口服递送的 hGH形式是有吸引力的治疗策略。
[0012] 发明简沐
[0013] 本公开提供用于将治疗剂（例如生物活性肽，如胰岛素、胰高血糖素、或生长激 素），例如通过口服或粘膜施用，递送至需要该治疗剂的受试者的靶位置的包含VSP-载体 的组合物和方法。
[0014] 更具体地，本公开提供VSP多肽如贾第虫寄生虫的可变表面蛋白（VSP)或其片段 (例如，贾第虫VSP的细胞外结构域或其包含CXXC基序的片段）作为载体通过口服或粘膜 施用递送治疗剂的用途。本发明的VSP载体没有通过肽键与治疗剂共价结合。
[0015] 因此，本公开提供包含VSP载体和治疗剂的治疗组合物。在一些实施方案中，组合 物配制用于口服施用。在其他实施方案中，组合物配制用于粘膜施用。在一些实施方案中， VSP载体是VSP、VSP样蛋白、VSP或VSP样蛋白片段、VSP或VSP样蛋白衍生物、或两个或更 多个所述VSP载体的组合。
[0016] 在一些实施方案中，VSP载体包含来自贾第虫的VSP或其片段。在其他实施方案 中，来自贾第虫的VSP或其片段包含VSP细胞外结构域。在其他实施方案中，来自贾第虫的 VSP是VSP1267。在一些具体的实施方案中，VSP载体包含氨基酸序列SEQ ID NO :2。在其 他实施方案中，VSP载体进一步包含异源部分。在一些实施方案中，异源部分是蛋白质纯化 标签序列。在一些实施方案中，蛋白质纯化标签序列是His6标签。在一些具体的实施方案 中，VSP载体由序列SEQ ID NO :1组成。
[0017] 在一些实施方案中，治疗剂是生物剂。在一些实施方案中，生物剂是生物活性肽。 在一些实施方案中，生物活性肽是胰岛素，人生长激素、胰高血糖素，其片段、类似物、衍生 物或变体，或两个或更多个所述生物活性肽的组合。在一些实施方案中，生物活性肽是天然 胰岛素。在其他实施方案中，生物活性肽是重组胰岛素。在一些实施方案中，生物活性肽是 膜岛素类似物。在其他实施方案中，膜岛素类似物是速效膜岛素。在其他实施方案中，膜岛 素类似物是长效胰岛素。在一些实施方案中，速效胰岛素是门冬胰岛素 （insulin Aspart)。 在其他实施方案中，长效胰岛素是甘精胰岛素 （insulin Glargine)。
[0018] 在一些实施方案中，VSP载体与治疗剂的分子-分子比率范围从约10:1至约 1:10。在其他实施方案中，VSP载体与治疗剂的分子-分子比率范围从约3:1至约1:3。在 一些实施方案中，VSP载体与治疗剂的分子-分子比率是3:1。在其他实施方案中，VSP载 体与治疗剂的分子-分子比率是1:1。在一些实施方案中，组合物进一步包含药学上可接受 的赋形剂。
[0019] 还提供将治疗剂递送至受试者中的靶位置的方法，该方法包括向需要该治疗剂的 受试者施用包含VSP载体和治疗剂的治疗组合物。本公开还提供治疗受试者的疾病或状况 的方法，包括向需要治疗的受试者施用有效量的包含VSP载体和治疗剂的治疗组合物。在 一些实施方案中，疾病或状况是激素缺乏症。在一些实施方案中，疾病缺乏症是胰岛素缺乏 症。在一些实施方案中，胰岛素缺乏症是1型糖尿病。
[0020] 还提供治疗受试者的疾病或状况的方法，包括将VSP载体和治疗剂组合，其中所 述VSP载体与所述治疗剂结合，以及向所述受试者施用有效量的所述VSP载体与治疗剂的 组合。本公开还提供增强治疗剂对酶降解的抗性的方法，包括将VSP载体和治疗剂组合，其 中所述VSP载体可以与所述治疗剂结合，且其中将VSP载体和治疗剂组合导致所述治疗剂 对酶降解的抗性的增强。
[0021] 本公开还提供增强治疗剂对pH变性的抗性的方法，包括将VSP载体和治疗剂组 合，其中所述VSP载体可以与所述治疗剂结合，且其中将所述VSP载体和所述治疗剂组合导 致所述治疗剂对PH变性的抗性的增强。还提供增强治疗剂对粘膜上皮细胞附着性的方法， 包括将VSP载体和治疗剂组合，其中所述VSP载体可以与所述治疗剂结合，且其中将所述 VSP载体和所述治疗剂组合导致所述治疗剂对粘膜上皮细胞附着性的增强。在一些实施方 案中，粘膜上皮细胞是小肠上皮细胞。在其他实施方案中，粘膜上皮细胞是胃上皮细胞。在 一些实施方案中，粘膜上皮细胞是口腔上皮细胞。
[0022] 还提供制备可口服递送的组合物的方法，包括将VSP载体和治疗剂组合，其中所 述VSP载体可以与所述治疗剂结合。本公开还提供制备适用于口服施用的可注射组合物 (例如，可注射胰岛素制剂）的方法，包括将VSP载体和治疗剂组合，其中所述VSP载体可以 与所述治疗剂结合。例如，可注射胰岛素组合物可以通过将可注射组合物与VSP载体组合 重新配置或制备以适用于口服施用。本公开还提供制备适用于口服施用的可注射治疗剂的 方法，包括将VSP载体和治疗剂组合，其中所述VSP载体可以与所述治疗剂结合。例如，可注 射胰岛素组合物可以通过将可注射组合物与VSP载体组合重新配置或制备以适用于口服 施用。在一些实施方案中，VSP载体是VSP、VSP样蛋白、VSP或VSP样蛋白片段、VSP或VSP 样蛋白衍生物、或两个或更多个所述VSP载体的组合。在一些实施方案中，VSP载体包含来 自贾第虫的VSP或其片段。在其他实施方案中，来自贾第虫的VSP或其片段包含VSP细胞外 结构域。在一些实施方案中，来自贾第虫的VSP是VSP1267。在其他实施方案中，VSP载体 包含氨基酸序列SEQ ID NO :2。在一些实施方案中，VSP载体进一步包含异源部分。在其他 实施方案中，异源部分是蛋白质纯化标签序列。在一些实施方案中，蛋白质纯化标签序列是 His6标签。在其他实施方案中，VSP载体由序列SEQ ID NO: 1组成。在一些实施方案中，治 疗剂是生物剂。在其他实施方案中，生物剂是生物活性肽。在一些实施方案中，生物活性肽 是胰岛素，人生长激素，胰高血糖素，其片段、类似物、衍生物或变体，或两个或更多个所述 生物活性肽的组合。在一些实施方案中，生物活性肽是天然胰岛素。在其他实施方案中，生 物活性肽是重组胰岛素。在一些实施方案中，生物活性肽是胰岛素类似物。在其他实施方 案中，膜岛素类似物是速效膜岛素。在一些实施方案中，膜岛素类似物是长效膜岛素。在其 他实施方案中，速效膜岛素是门冬膜岛素。在一些实施方案中，长效膜岛素是甘精膜岛素。
[0023] 附图简沐
[0024] 图IA是显示VSP结构特征的示意图。该图表明，VSP是具有富含CXXC基序（其 中C代表半胱氨酸，和X可以是任意氨基酸）的可变细胞外区域、独特跨膜疏水区域和短的 5个氨基酸长度的胞质尾的膜内在蛋白。
[0025] 图IB示出了一组贾第虫滋养体的相差（左图）和免疫荧光（右图）分析。每个 滋养体在其表面上表达单一 VSP，如用抗VSP特异性单克隆抗体的表面标记所示的，每个滋 养体表达的VSP各不相同。
[0026] 图IC示出了滋养体表面的抗VSP特异性免疫金标记。标记了寄生虫的整个表面， 包括腹盘和鞭毛，从而形成厚的表面包被。
[0027] 图2A示出了与用100 μ g/mL或200 μ g/mL胰蛋白酶处理的两个不同的贾第虫分 离物（WB和GS/Μ)相对应的相差（PC)图像和免疫荧光（IFA)图像。单克隆抗体G10/4识别 GS/Μ分离物的VSPH7 VSP蛋白中的构象表位。单克隆抗体9B10检测WB分离物的VSP9B10 VSP蛋白中的非构象表位。
[0028] 图2B示出了与在不同pH(l、3、5和8)下孵育的两个不同贾第虫分离物（WB和GS/ M)相对应的相差（PC)图像和免疫荧光（IFA)图像。单克隆抗体G10/4识别GS/Μ分离物的 VSPH7 VSP蛋白中的构象表位。单克隆抗体9B10检测WB分离物的VSP9B10 VSP蛋白中的 非构象表位。
[0029] 图3示出了滋养体胰蛋白酶化后检测三种贾第虫VSP (VSP9B10、VSP1267和VSPH7) 存在的蛋白质印迹分析。滋养体用浓度为200 μ g/mL和2mg/mL的胰蛋白酶处理，或在没有 胰蛋白酶的培养基中孵育（对照）。还示出了与小鼠抗碱性磷酸酶抗体（α-小鼠）相对应 的对照样品。
[0030] 图4示出了来自感染了 WB9B10贾第虫滋养体的长爪沙鼠 （Meriones unguiculatus)(沙鼠）（图4Α)、对照沙鼠（图4Β)和口服施用了纯化自转基因滋养体的全 部贾第虫VSP组的沙鼠（图4C)的肠切片的免疫组织化学显微照片。
[0031] 图5A示出了与VSP1267的细胞外部分加上C-末端His6标签（加框的氨基酸） 相对应的重组贾第虫VSP的氨基酸序列（SEQ ID NO :1)。N-末端信号肽加上了下划线。
[0032] 图5B示出了通过SDS-PAGE和使用抗His6单克隆抗体的蛋白质印迹法纯化在杆 状病毒系统中产生的重组VSP1267的步骤。
[0033] 图6示出了与用不同浓度的胰蛋白酶和胰液素（胰液成分的混合物）预孵育的胰 岛素（NOVORAP1D⑧和LANTUS? )相对应的银染凝胶。标记丽的泳道对应于分 子量梯。"胰岛素"和"胰蛋白酶"泳道分别是包含胰岛素和胰蛋白酶的对照泳道。
[0034] 图7示出了 7周大的雌性Balb/c小鼠的血糖水平，所述小鼠在2小时没有进食后 接受所示剂量的胰岛素。图7A示出了施用LANTUS?后的血糖水平；而图7B示出了施 用NOVORAP1D⑧后的血糖水平。以1IU、5IU和50IU的剂量口服施用胰岛素。用PBS 和1-5IU皮下施用的膜岛素作为对照。IIU似乎对于两种膜岛素是亚适量（加圆圈的）。
[0035] 图8示出了 7周大的雌性Balb/c小鼠的血糖水平，所述小鼠在2小时没有进食后 接受单独的所示剂量的胰岛素或与VSP载体的组合。图8A示出了施用LANTUS?后的 血糖水平；而图8B示出了施用NOVORAP1D?后的血糖水平。用三种不同的制剂以图 7中测定的亚适量（Iiu)施用胰岛素：⑴单独施用胰岛素，（ii)以分子-分子比率1:1与 VSP组合的胰岛素，和（iii)分子-分子比率1:3与VSP组合的胰岛素。用PBS和1-5IU皮 下施用的胰岛素作为对照。IIU胰岛素与VSP载体的组合（对LANTUS?胰岛素与VSP 的比率为1:1，和对NOVORAPID⑧胰岛素与VSP的比率为1:3)增强了胰岛素的生物作 用（加圆圈的）。
[0036] 图9通过蛋白质印迹法示出了抗hGH单克隆抗体（a hGH)的特异性。用该单克隆 (ahGH)的两种稀释液（1/3000和1/2000)检测hGH(在大肠杆菌（E.coli)中重组产生的 人生长激素）。还示出了含有抗碱性磷酸酶抗体（a小鼠-API)的对照。
[0037] 图IOA示出了 pH对hGH稳定性的作用。上部图像是示出了在pH1.6、2. 0、3. 8、 5. 0、5. 8、7. 0、8. 0、9. 0、10. 0和11. 0的培养基中孵育的hGH的pH介导降解的蛋白质印迹分 析。用抗hGH单克隆抗体确定了 hGH的存在。下部图像示出了 hGH的银染检测。低pH，与 在GIT中发现的相似，导致了蛋白质的降解（圆圈），而在更高pH下，hGH与对照相比保持 不变。每个泳道含有10 Ug hGH。
[0038] 图IOB示出了在低pH下将VSP载体与hGH组合对hGH变性的作用。蛋白质印迹对 应于样品对，其中没有VSP载体的hGH样品或hGH与VSP载体的比率为1:3的具有VSP载 体的 hGH 样品经历相同的 pH 条件（pH L 4、1· 96、3· 8、4· 91、5· 9、7· 01、7· 95、8· 51、9· 61 和 11. 17)。在处理过程中丢失了 pH 3. 8下的hGH :VSP载体样品。用抗hGH单克隆抗体确定 了 hGH的存在。
[0039] 图IlA示出了胰蛋白酶对hGH稳定性的作用。上部图像是使用抗hGH单克隆抗 体的蛋白质印迹染色。下部图像对应于银染。如圆圈区域所示，胰蛋白酶完全蛋白水解了 hGH 〇
[0040] 图IlB表明以l:3hGH:VSP的比率组合VSP载体与hGH保护hGH不被胰蛋白酶（高 达150 μ g/mL胰蛋白酶）降解。蛋白质印迹对应于样品对，其中没有VSP载体的hGH样品 或hGH与VSP载体比率为1:3的具有VSP载体的hGH样品遭受相同的胰蛋白酶浓度（50、 100、150、300和50(^8/1^)。用抗116!1单克隆抗体确定了116!1的存在。
[0041] 图12A在主图中示出了口服施用指定hGH剂量（50、100、200、400和80(^8)后小 鼠中hGH的血清水平。插图示出了皮下施用12. 5 μ g剂量的hGH后小鼠中hGH的血清水平。
[0042] 图12B示出了单独或以1:3的hGH:VSP载体比率与VSP载体组合口服施用hGH后 小鼠中hGH的血清水平。
[0043] 图13A示出了胰蛋白酶对胰高血糖素稳定性的作用。斑点印迹的上图显示胰蛋白 酶蛋白水解的胰高血糖素。下图示出了以1:3胰高血糖素：VSP比率组合VSP载体与胰高 血糖素保护胰高血糖素不被胰蛋白酶降解直到1:2(蛋白质：蛋白酶）的比率。
[0044] 图13B示出了由向BALC/c小鼠单独或与VSP组合施用胰高血糖素造成的对血糖 水平的影响。
[0045] 图14A示出了衍生自嗜热四膜虫（Tetrahymena thermophila)的VSP样蛋白 (SEQ ID N0:590)的嵌合VSP蛋白（SEQ ID N0:589)的序列。将编码肠贾第虫（Giardia intestinalis)VSP1267信号肽和His6纯化标签的序列（SEQ ID N0:591)分别与VSP结构 域序列（SEQ ID N0:592)的氨基末端和羧基末端融合，该VSP结构域位于来自四膜虫的VSP 样蛋白的氨基酸位置977和1465之间。
[0046] 图14B示出了如由使用抗hGH单克隆抗体的蛋白质印迹法测定的，不同浓度的胰 蛋白酶对重组hGH的活性。
[0047] 图14C表明hGH与来自嗜热四膜虫的VSP样蛋白的组合能够保护hGH免于在低pH 和胰蛋白酶下降解，如在SDS-PAGE后的考马斯蓝染色和使用抗hGH单克隆抗体的蛋白质印 迹所示的。
[0048] 图15A表明IL-2或IL-10与VSP的组合能够保护IL-2和IL-10不被胰蛋白酶降 解，如在SDS-PAGE后的考马斯蓝染色中所示的。
[0049] 图15B表明IL-10与VSP的组合能够保护IL-10免于低pH诱导的降解，如在 SDS-PAGE后的考马斯蓝染色中所示的。
[0050] 图15C表明IL-2与VSP的组合能够保护IL-2和IL-2免于低pH诱导的降解，如 在SDS-PAGE后的考马斯蓝染色中所示的。
[0051] 发明详沐
[0052] -般通过注射施用的生物活性肽（如胰岛素、胰高血糖素或生长激素）的口服递 送提供减少注射次数、提高依从性和减少副作用发生的可观益处。然而，治疗剂（例如生 物活性肽，如胰岛素、胰高血糖素或人生长激素（hGH))的成功口服递送涉及克服酶降解障 碍、实现上皮通透性以及在制备过程中采取保存生物活性的步骤。为了解决这个问题，我们 提供一个口服递送系统，其中生物活性肽（如胰岛素、胰高血糖素或hGH)与VSP载体组合， 但不是通过肽键共价结合，以保护所述生物活性肽在胃肠道（GIT)中不被降解并促进它的 全身性生物学作用。
[0053] 因此，本公开涉及包含含有至少一个CXXC基序的VSP载体（例如，贾第虫VSP，VSP 样蛋白，其片段、变体或衍生物）的治疗组合物，其中C是半胱氨酸氨基酸，和X是任意氨基 酸，所述VSP载体可以与治疗剂组合和与其结合，且作为用于药物递送的载体发挥作用。本 公开尤其涉及包含VSP载体（例如衍生自贾第虫VSP的细胞外结构域的多肽）的组合物， 所述VSP载体具有对蛋白酶和不同pH的抗性，且能够附着于GIT中的上皮细胞。在一些实 施方案中，这种VSP载体被用于形成适合于口服施用的病毒样颗粒（VLP)。
[0054] 用于口服或粘膜施用的治疗剂与VSP载体的组合赋予所述治疗剂对pH诱导的降 解和酶降解的增强的抗性，并增加了所述治疗剂对胃肠上皮的结合。在一些具体的方面，所 述治疗剂是生物活性肽，如胰岛素、胰高血糖素或人生长激素。
[0055] 定义
[0056] 必须注意，如在本说明书和所附权利要求书中所用的，除非文