一种携载抗肿瘤药物连接CD22单抗靶向淋巴瘤的血小板靶向载药体系的制备方法与流程

本发明属于生物药物载体制备领域，尤其涉及一种以连接cd22单抗靶向淋巴瘤细胞的血小板作为靶向药物载体携载抗肿瘤药物的制备方法。

背景技术：

恶性淋巴瘤是一组原发于淋巴组织的恶性肿瘤，按病理和临床特点可分为两大类：霍奇金淋巴瘤(hl)和非霍奇金淋巴瘤(nhl)，后者占90％以上。nhl发病率近年来急剧增加，其中，b细胞淋巴瘤是与恶性b细胞单克隆扩增相关的一组异质性肿瘤，约占成人nhl的85％。高度异质性血液恶性肿瘤的b细胞淋巴瘤表现出不同的临床和生物学特征。尽管治疗反应有所进展，但高水平b细胞nhl的5年生存率低于50％，化疗依然是b细胞淋巴瘤的一线治疗。但是化疗具有明显的副作用，包括骨髓抑制、免疫功能低下、消化道反应等，提高药物的靶向性、降低治疗的毒副作用成为目前淋巴瘤诊治的挑战，所以研究和开发能将抗淋巴瘤药物靶向传递到肿瘤细胞内部或周围以期较少副反应的药物载体具有十分重要的意义。

目前而言，药物载体主要包括磁性纳米药物载体、脂质体载体、微粒载体等，但它们均存在诸多缺点，如载药率不高，稳定性较差，毒性作用较强等，因而生物药物载体凭借其良好的生物相容性、缓控释药等特点在众多载药体系中脱颖而出。

以生物作为药物载体的研究已进行了很多年，研究较为深入的包括白蛋白载药和红细胞载药等。临床上应用成功的典型范例是以人血清白蛋白为载体的紫杉醇产品，研究显示其可在肿瘤细胞和组织中蓄积，可用于治疗乳腺癌、卵巢癌等。另外的研究显示，经红细胞包载后释放的甲氨蝶呤和长春新碱等药物，抑制肿瘤生长及诱导其凋亡的效果较裸药更为显著。

血小板是从骨髓成熟的巨核细胞脱落下来的碎片，直径约2um，在成人血液中数量约为(1-3)×10¹¹个/l，其寿命约7-14天，平均9天，衰老的血小板大多被肝脏中的kupfer细胞清除，因而血小板具有良好的生物相容性、安全性及较长的血循环时间。血小板在止血、愈合伤口、血栓形成等过程中起着重要作用，并且与肿瘤的发生发展也具有密切的关系。肿瘤细胞经过一系列反应活化血小板，活化的血小板通过肿瘤细胞诱导的血小板聚集(tcipa)作用聚集在肿瘤细胞周围，形成血小板-肿瘤细胞复合物，正是这种作用促进了血小板与肿瘤细胞的粘附，并且活化后的血小板将摄取的药物释放，而血小板摄取药物及小颗粒的作用与巨噬系统的吞噬作用不同，即不会将内吞的物质杀死和清除，从而保证了药物原有的结构和活性，保留了药效。另外研究显示，血小板的载药率远高于纳米颗粒的载药率，且血小板与细胞毒药物具有协同作用，可以增加其杀伤作用。

然而血小板的特异性和精确靶向的挑战限制了它们作为药物载体的功效。相比之下，单克隆抗体(mab)是高度特异性和精确的靶向系统。结合了药物的肿瘤特异性抗体可以将药物引导到肿瘤细胞，证明其可能用于靶向药物递送。由于90％以上的b细胞淋巴瘤细胞上有cd22抗原表达，且cd22抗原的表达率为80％-100％，远高于正常成熟b淋巴细胞，并且结合cd22的抗体可以被迅速内化，cd22作为化学免疫偶联物也因此引起了特别注意，被用于将细胞毒性药物靶向递送至肿瘤细胞。

因此，在这项工作中，我们建议使用连接cd22单抗的血小板作为治疗b细胞淋巴瘤的新型药物靶向递送系统，其具有含量丰富、生物相容性好、载药率高、主动靶向性好、对肿瘤细胞疗效高而对正常组织损害小的优势，这方面目前还没有相关的研究报导。

技术实现要素：

为克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种以连接cd22单抗的血小板作为药物载体包载抗肿瘤药物的制备方法，制成携载抗肿瘤药物连接cd22单抗的血小板靶向载药体系，具有生物相容性好、载药率高、主动靶向性强、在肿瘤组织的酸性环境中释放率高，从而增加药物的抗肿瘤活性等优点。

为达到上述目的，本发明是通过以下的技术方案来实现的。

一种携载抗肿瘤药物连接cd22单抗靶向淋巴瘤的血小板靶向载药体系的制备方法，包括以下步骤：

(1)环境温度为20±5℃，在全血中加入重量百分含量为2-4％柠檬酸钠溶液，离心后得到血小板丰富血浆；

(2)将步骤(1)得到的血小板丰富血浆再深度离心，并用pbs缓冲液洗涤至不再含有血浆及其他血液成分，得到洗涤血小板；

(3)将步骤(2)得到的洗涤血小板与3-马来酰亚胺基苯甲酸-n-羟基琥珀酰亚胺酯试剂(mbs)试剂在37±0.5℃的避光环境中震荡反应1～2小时，离心洗涤，得到表面修饰(马来酰亚胺基团)指向巯基的血小板。

(4)将抗cd22单抗与traut’s试剂在37±0.5℃的避光环境中震荡反应1～2小时，然后超滤离心，得到富含巯基的抗cd22单抗。

(5)将步骤(3)得到的表面修饰为指向巯基的马来酰亚胺基团的血小板与步骤(4)得到的富含巯基的抗cd22单抗混合，在37±0.5℃的避光环境中震荡反应8～12小时，经离心洗涤，得到连接cd22单抗的血小板。

(6)将步骤(5)得到的连接cd22单抗的血小板与抗肿瘤药物在37±0.5℃的避光环境中震荡反应1～2小时，得到抗肿瘤药物与连接cd22单抗的血小板反应物。

(7)将步骤(6)得到的抗肿瘤药物与连接cd22单抗的血小板反应物通过琼脂糖凝胶2b分离柱分离，并离心洗涤，得到携载抗肿瘤药物连结cd22单抗的血小板靶向载药体系。

所述步骤(1)中，全血与重量百分含量为2-4％柠檬酸钠溶液的体积比为7:1～10:1，优选为9:1。

所述步骤(1)中离心为以1200rpm离心5～10min。

所述步骤(2)中深度离心为以3600rpm离心8～12min。

所述步骤(2)得到洗涤血小板计数控制在(2.5-3.0)×10⁵/ul。

所述步骤(3)中洗涤血小板与mbs试剂体积比为50：1。

所述步骤(3)中离心洗涤是用pbs缓冲液以3600rpm离心洗涤2～3次，每次5～8分钟。

所述步骤(4)中抗cd22单抗浓度为1mg/ml。

所述步骤(4)中抗cd22单抗与traut’s试剂的浓度比为50:1。

所述步骤(4)中超滤离心是于超滤离心管中3300rpm离心过滤20～30min。

所述步骤(5)中离心洗涤是用pbs缓冲液以3600rpm离心洗涤2～3次，每次5～8min。

所述步骤(6)中抗肿瘤药物为蒽环类抗肿瘤药物或烷化剂类抗肿瘤药物的一种，抗肿瘤药物的浓度为0.05～0.15mmol/l。

所述蒽环类抗肿瘤药物优选柔红霉素，烷化剂类抗肿瘤药物优选环磷酰胺。

所述步骤(6)中抗肿瘤药物与洗涤血小板的体积比为1～4:1，优选为2:1。

所述步骤(7)中离心洗涤是用pbs缓冲液以3600rpm离心洗涤2～3次，每次5～8min。

有益效果：与现有技术相比，本发明的优点在于：

(1)本发明将连接cd22单抗的血小板作为靶向生物载药系统，包载某些常见抗肿瘤药物应用于淋巴瘤的化学治疗中。血小板作为机体的一部分，具有良好的生物相容性，包载药物后不会引起免疫排斥反应，避免了作为外来物的纳米载药系统存在的排斥反应问题，可使携载的化疗药物血循环时间延长；同时血小板的含量丰富，其装载药物的量远远高于纳米载体。

(2)通过将化疗药物包载于连接cd22单抗的血小板中，由于cd22单抗有主动靶向递送作用，实现了将药物选择性释放于特定部位的目的，提高了药物对肿瘤组织的靶向性，从而增加了药物对肿瘤组织的疗效而减少了其对正常组织的损害，同时以较少的药物剂量即可达到相同的抗肿瘤作用，有效的减轻了药物副作用。这些都对提高患者生活质量和医疗质量具有重要意义，并且具有一定的社会和经济效益，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明制备的携载柔红霉素连接cd22单抗的血小板靶向载药体系的蛋白电泳考马斯亮蓝染色结果；其中第一泳道为单纯的血小板，第二泳道为携载柔红霉素的血小板，第三泳道为携载柔红霉素连接cd22单抗的血小板，第四泳道为单纯的抗cd22单抗。

图2为本发明制备的携载柔红霉素连接cd22单抗的血小板靶向载药体系的荧光显微镜图像；其中左图为单纯的血小板、右图为连接cd22单抗的血小板携载了柔红霉素。

图3为单独血小板和连接cd22单抗的血小板携载柔红霉素后的扫描电镜图像；其中左图为单纯的血小板、右图为连接cd22单抗的血小板携载了柔红霉素。

图4为连接cd22单抗的血小板载柔红霉素的药物体外释放曲线。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步的详细说明。

实施例1

一种携载柔红霉素连接cd22单抗的血小板靶向载药体系的制备方法，该方法包括如下步骤：

第一步：在环境温度为20±5℃的室温条件下，在取得的全血中加入重量百分比为3.2％柠檬酸钠溶液抗凝，全血与柠檬酸钠溶液的体积比为9:1，1200rpm离心5min后得到血小板丰富血浆；

第二步：血小板丰富血浆以3600rpm离心10min，并用pbs缓冲液洗涤三次，使其不再含有血浆及其他血液成分，弃去上清，得到洗涤血小板，控制血小板计数为(2.5-3.0)×10⁵/ul。

第三步：将洗涤血小板500μl的重悬液与10μlmbs试剂在37±0.5℃的避光环境中震荡反应1小时，3600rpm离心洗涤3次，每次8分钟，得到表面修饰(马来酰亚胺基团)指向巯基的血小板；将抗cd22单抗与traut’s试剂以浓度比50:1混合，在37±0.5℃的避光环境中震荡反应1小时，然后3300rpm超滤离心20min，得到抗富含巯基的cd22单抗。

第四步：将表面修饰(马来酰亚胺基团)指向巯基的血小板与富含巯基的抗cd22单抗混合，在37±0.5℃的避光环境中震荡反应8小时，并以3600rpm，8min离心洗涤3次，得到连接cd22单抗具有靶向淋巴瘤细胞功能的血小板。

第五步：将0.1mmol/l的柔红霉素与制得的连结cd22单抗的血小板混合，柔红霉素与血小板的体积比为2:1，轻轻将其吹打至混合均匀。将混合物在37±0.5℃的避光环境中以100rpm震荡反应1小时，然后通过琼脂糖凝胶2b分离柱分离，再用pbs缓冲液以3600rmp离心洗涤3次，每次8分钟，即得到新型携载柔红霉素连接cd22单抗的血小板靶向载药体系。

采用上述方法制备出的携载柔红霉素的血小板靶向载药体系，通过蛋白电泳考马斯亮蓝染色、荧光显微镜和扫描电镜进行表征，结果表明抗cd22单抗成功连接于血小板上、柔红霉素可被包载于血小板内且未影响血小板的形态，如图1、图2、图3所示。采用高效液相色谱法计算得到其包封率和包载率分别为61.3％和83.4％，表明药物的包封率及包载率均较高。通过观察不同ph环境中药物的释放率，证明酸性环境中药物的释放率明显增加如图4所示，表明血小板载药体系可减少细胞毒药物在正常细胞、组织的释放，从而降低化疗药物的毒副作用。

下面通过试验对本实施例的有益效果作进一步的详细说明。

1、蛋白电泳考马斯亮蓝染色结果证明了抗cd22单抗成功连接于血小板载药体系，如图1所示。由于柔红霉素具有自发荧光性，通过荧光显微镜观察靶向血小板载药体系，可见药物被包载于血小板内如图2所示，通过高效液相色谱法定量计算其载药率和包封率，分别为46.3％和86.6％，表明靶向血小板载药体系对蒽环类抗肿瘤药物具有较高的包载及包封率。通过扫描电镜，发现载药后的血小板形态与单纯的血小板形态相似，无明显改变如图3所示，说明药物不会对血小板造成明显影响，另外通过cck-8法检测到单纯的血小板对肿瘤细胞无明显影响，提示血小板可作为安全、高效的药物载体。

2、本发明制备的携载柔红霉素连接cd22单抗的血小板靶向载体，药物释放曲线结果显示由靶向血小板包载的药物在肿瘤组织的酸性环境中释放较多且具有缓释作用，而在中性和碱性环境中的释放明显减少如图4所示，因此降低了化疗药物对机体的毒副作用，并延长了药物在体内的半衰期。

3、cck-8实验结果显示：与裸药相比，携载柔红霉素的血小板载药体系和携载柔红霉素连接cd22单抗的血小板靶向载药体系体外作用于人类淋巴瘤细胞株raji细胞株后，对细胞生长的抑制作用更加明显；并且后者抑制效果更显著。

4、通过流式细胞术和dapi染色，发现与裸药相比，携载柔红霉素的血小板载药体系和携载柔红霉素连接cd22单抗的血小板靶向载药体系体可促进raji细胞的凋亡，且后者效果更显著。并且用流式细胞术检测到血小板靶向载药体系显著增加了肿瘤细胞内的药物浓度，从某种程度上解释了由血小板携载后的柔红霉素抗肿瘤作用增加的原因。

实施例2

一种携载环磷酰胺连接cd22单抗的血小板载药体系的制备方法，该方法包括如下步骤：

第一步：在环境温度为20±5℃的室温条件下，在取得的全血中加入重量百分比为4％柠檬酸钠溶液抗凝，全血与柠檬酸钠溶液的体积比为10:1，1200rpm离心8min后得到血小板丰富血浆；

第二步：血小板丰富血浆以3600rpm离心12min，并用pbs缓冲液洗涤三次，使其不再含有血浆及其他血液成分，弃去上清，得到洗涤血小板，控制血小板计数为(2.5-3.0)×10⁵/ul。

第三步：将洗涤血小板500μl的重悬液与10μlmbs试剂在37±0.5℃的避光环境中震荡反应1.5小时，3600rpm离心洗涤2次，每次6分钟，得到表面修饰(马来酰亚胺基团)指向巯基的血小板；将抗cd22单抗与traut’s试剂以浓度比50:1混合，在37±0.5℃的避光环境中震荡反应1.5小时，然后3300rpm超滤离心30min，得到抗富含巯基的cd22单抗。

第四步：将表面修饰(马来酰亚胺基团)指向巯基的血小板与富含巯基的抗cd22单抗混合，在37±0.5℃的避光环境中震荡反应12小时，并以3600rpm，6min离心洗涤2次，得到连接cd22单抗具有主动靶向淋巴瘤细胞功能的血小板。

第五步：将0.05mmol/l的环磷酰胺与制得的连接cd22单抗的血小板混合，环磷酰胺与血小板的体积比为2:1，轻轻将其吹打至混合均匀。将混合物在37±0.5℃的避光环境中以100rpm震荡反应1.5小时，然后通过琼脂糖凝胶2b分离柱分离，再用pbs缓冲液以3600rmp离心洗涤2次，每次6分钟，即得到新型携载环磷酰胺连接cd22单抗的血小板靶向载药体系。

通过高效液相色谱法定量计算其包封率和包载率，分别为41.3±3.4％和82.4±2.7％，表明血小板靶向载药体系对烷化剂类抗肿瘤药物具有较高的包封及包载率。

本发明按照上述实施例进行了说明，应当理解，上述实施例不以任何形式限定本发明，凡采用等同替换或等效变换方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。