肿瘤靶向光热响应可控释放药物纳米传输载体的制备方法与流程

本发明属于药物载体制备的技术领域，具体涉及肿瘤靶向光热响应可控释放药物纳米传输载体的制备方法。

背景技术：

癌症作为一种具有较高致死率的疾病，严重威胁着人类健康。化学药物治疗和放射疗法的直接使用在杀死肿瘤细胞的同时，也对正常细胞和组织造成了不可逆的损伤。与传统的化学疗法相比，光动力学治疗则借助光敏药物将特定波长的光能转化产生单线态氧，利用单线态氧杀死癌细胞，所以对肿瘤细胞具有较好的选择性及较小的毒副作用。但多数光敏药物的水溶性和分散性较差，因此，制备一种纳米药物的传输载体旨在将光敏药物靶向传输进入肿瘤细胞，并在特定刺激条件下实现药物可控释放至关重要。同时借助材料的光热性能还可进一步提高癌症的治疗效果，对癌症多协同诊疗的发展具有重要意义。

在众多的光敏药物纳米传输载体中，多孔二氧化硅材料的应用最为普遍。利用多孔二氧化硅的三维空腔结构和表面的功能基团可以物理吸附或共价连接光敏药物，并将其传输进入肿瘤细胞。虽然硅质材料性质稳定，但只能作为单一载体使用，材料自身无法提供辅助功能以增强光动力治疗效果。除此之外，胶束、有机聚合物纳米粒子、纳米脂质体和树枝状大分子也被大量用于光敏药物的传输，以上纳米载体虽然具有较好的生物相容性，丰富的功能基团也有利于材料的功能化修饰。但多数材料的合成步骤较为复杂，涉及大量有机溶剂的使用，成本高，耗时长。

此外，氧化石墨烯具有独特的光热性能，作为药物传输载体也备受关注。然而，除繁琐的共价方式连接外，氧化石墨烯只能装载具有芳香环结构的疏水性光敏药物，且无法有效避免药物的提前泄漏和实现药物在细胞内的精准可控释放。相对单一的载药模式和有限的表面功能化修饰严重制约了氧化石墨烯在光敏药物传输及其在癌症光动力治疗中的应用。

因此，针对光敏药物较差的水溶性以及不同类型纳米载体开发中存在的不足，如何将光敏药物靶向传输进入肿瘤细胞，在应激条件下实现药物可控释放，并借助材料的光热性能以提高癌症光动力治疗效果是光敏药物纳米传输载体制备的巨大挑战。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术不足，提供了一种肿瘤靶向光热响应可控释放药物纳米传输载体的制备方法。所制得的肿瘤靶向光热响应可控释放药物纳米传输载体具有癌细胞靶向功能、可通过光热响应控制药物释放、可用于传输各种不同药物（疏水性药物、亲水性药物和带电荷药物等）以及良好的光热转化性能，可增强癌症的光动力治疗效果。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种肿瘤靶向光热响应可控释放药物纳米传输载体的制备方法，借助聚多巴胺中邻苯二酚基的强还原性，用多巴胺将氧化石墨烯还原为还原氧化石墨烯，赋予还原氧化石墨烯更好的光热性能；利用协同组装机理，将多孔二氧化硅组装在还原氧化石墨烯两侧，形成三明治结构的纳米复合材料，利用二氧化硅的三维孔洞空腔物理吸附装载光敏药物；通过静电作用将透明质酸吸附于载药平台表面，防止药物提前泄漏且实现对肿瘤细胞的靶向识别；具体包括以下步骤：

（1）还原氧化石墨烯-聚多巴胺（rgo-pda）的制备：用hummers法制备得到氧化石墨烯，取氧化石墨烯超声分散于tris-hcl缓冲液中，离心，收集单层氧化石墨烯上清液；移取单层氧化石墨烯分散液于tris-hcl缓冲液中，水浴加热至70℃，加入盐酸多巴胺，持续加热搅拌反应24h；反应结束后，将生成的还原氧化石墨烯-聚多巴胺（rgo-pda）纳米片透析透析一周并在4℃下保存，备用；

（2）多巴胺还原氧化石墨烯@多孔二氧化硅（rgo-pda@ms）的制备：在磁力搅拌下，加入2.4mg步骤（1）合成的rgo-pda、1.2mmol十六烷基三甲基溴化铵（ctab）、0.15mmol氢氧化钠（naoh）于150ml水中，分三次加入总计1.8ml四乙基原硅酸盐（teos），室温反应24h；之后，向反应液中加入67µl3-氨丙基三乙氧基硅烷（aptes），并继续反应12h；反应结束后经离心、洗涤制得还原氧化石墨烯@多孔二氧化硅（rgo-pda@ms）；

（3）药物纳米传输载体的制备：将步骤（2）制得的rgo-pda@ms与透明质酸（ha）按质量比1:2混合搅拌24h，使透明质酸通过静电引力包裹于载体表面，再经离心、洗涤，制得所述肿瘤靶向光热响应可控释放药物纳米传输载体(rgo-pda@ms/ha)，并分散于磷酸缓冲盐溶液（pbs）中，备用。

步骤（1）中所述单层氧化石墨烯上清液的浓度为2mg/ml。

步骤（1）中所述tris-hcl缓冲液的浓度为10mm，ph为8.5。

步骤（1）中添加的盐酸多巴胺与单层氧化石墨烯分散液的质量体积比为2:1。

步骤（2）中所述3-氨丙基三乙氧基硅烷的浓度为1m。

本发明的有益效果在于：

（1）本发明所制备的药物纳米传输载体，制备方法简单，并突破了氧化石墨烯载药的局限性，可用于装载各种不同药物（疏水性药物、亲水性药物和带电荷药物等），具有良好的生物兼容性；

（2）具有癌细胞靶向和药物光热可控释放功能：可将各种药物靶向传输到cd-44过表达癌细胞，且可有效防止药物泄漏，并通过808nm激光照射控制药物在癌细胞内的释放；

（3）本发明制备的药物纳米传输载体具有还原氧化石墨烯一样的良好的光热性能，可实现光热增强型光动力治疗，提高癌症的光动力治疗效果。

附图说明

图1多巴胺还原氧化石墨烯@多孔二氧化硅纳米复合材料（rgo-pda@ms）的透射电镜图；

图2rgo-pda@ms肿瘤靶向光热响应可控释放药物纳米传输载体在808nm1.5w激光照射下光热升温曲线；

图3rgo-pda@ms/ce6/ha肿瘤靶向光热响应可控释放药物纳米传输载体的光热响应药物可控释放曲线；

图41.5μmrgo-pda@ms/ce6/ha分别与cd-44过表达癌细胞hct-116（靶向）、cd-44过表达癌细胞ht29（靶向）和正常细胞nih3t3（对照）细胞培养6h，经hoechst33342细胞核染色后的激光共聚焦细胞摄入图；

图5经2μmce6或rgo-pda@ms/ce6/ha处理的cd-44过表达癌细胞hct-116（靶向）、cd-44过表达癌细胞ht29（靶向）和正常细胞nih3t3（对照）细胞在不同条件下的细胞活力图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不仅仅限于这些实施例。

实施例

将3g石墨粉与1.5g硝酸钠（nano3）分散在70ml浓硫酸（h2so4）中，在冰水浴中快速搅拌，并缓慢加入9g高锰酸钾（kmno4）。在35℃下搅拌30分钟（min），加入300ml超纯水稀释，缓慢加入20ml的双氧水（h2o2）。反应结束后，将溶液在10000rpm下离心，收集离心沉淀物获得氧化石墨烯（go），并用10%盐酸（hcl）和超纯水交替清洗，置于14000da的透析袋，用超纯水透析一周以去除杂质离子。最后将氧化石墨烯放入50℃真空干燥箱中干燥，备用。将上述制备的0.5g氧化石墨烯分散在100ml10mm的三羟甲基氨基甲烷（tris-hcl）缓冲溶液(ph8.5)中，超声分散3h。将氧化石墨烯分散液高速（30000rpm）离心1h，收集单层氧化石墨烯（尺寸约为200nm）上清液(2mg/ml)。

移取上述氧化石墨烯分散液25ml于75ml10mm的tris-hcl(ph8.5)缓冲溶液中，水浴加热至70℃，加入50mg盐酸多巴胺，持续加热搅拌反应24h。反应结束后，将生成的还原氧化石墨烯-聚多巴胺（rgo-pda，尺寸约为200nm）纳米片置于14000da的透析袋，用超纯水透析一周并在4℃下保存，备用。

在磁力搅拌下，加入2.4mg上述合成的还原氧化石墨烯-聚多巴胺（rgo-pda），1.2mmol十六烷基三甲基溴化铵（ctab），0.15mmol氢氧化钠（naoh）于150ml水溶液中。分三次，间隔30min加入总计1.8ml四乙基原硅酸盐（teos），室温反应24h。之后，向反应液中加入67µl1m3-氨丙基三乙氧基硅烷（aptes），并继续反应12h。反应结束后，将溶液以10000g离心30min，用甲醇、乙醇交替清洗5次，收集具备良好光热性能的还原氧化石墨烯@多孔二氧化硅（rgo-pda@ms）（图1、2）。

将rgo-pda@ms与透明质酸（ha）按质量比1:2混合搅拌24h，使ha通过静电引力包裹于载体表面，防止药物泄漏的同时，赋予载体靶向识别功能。将反应液在10000g离心力下离心，并用超纯水洗涤去除多余的ha，制得所述肿瘤靶向光热响应可控释放药物纳米传输载体(rgo-pda@ms/ha)，将rgo-pda@ms/ha分散于磷酸缓冲盐溶液（pbs）中，备用。

应用例（在传输光敏药物二氢卟吩e6（ce6）和cd-44过表达癌细胞光动力治疗上的应用）

将本发明方法步骤（1）中已制备的rgo-pda@ms与药物（ce6）水溶液按照质量比1:1混合，室温搅拌12h将ce6装载在rgo-pda@ms的多孔二氧化硅中（rgo-pda@ms/ce6）。在完成药物装载后，离心洗涤，去除多余的药物。将装载了光敏药物ce6的rgo-pda@ms（rgo-pda@ms/ce6）与透明质酸（ha）按质量比1:2混合搅拌24h，使ha通过静电引力包裹于载体表面（rgo-pda@ms/ce6/ha），防止药物泄漏的同时，赋予载体靶向识别功能。将反应液在离心力10000g下离心，并用超纯水洗涤去除多余的ha，完成ce6肿瘤靶向光热响应药物传输载体(rgo-pda@ms/ce6/ha)的构建，并将rgo-pda@ms/ce6/ha分散于磷酸缓冲盐溶液（pbs，ph=7.4）中，4℃保存备用。

（2）将200μl上述rgo-pda@ms/ce6/ha载药平台（ce6，3μg/ml）通过皮下注射至小鼠肿瘤部位。注射后12h，肿瘤部位先用1w/cm²的808nm激光照射10min，再用0.05w/cm²的660nm激光照射5min，对肿瘤进行光热增强光动力治疗，跟踪小鼠肿瘤大小与体重变化。从图2可以看出,在波长为808nm，功率为1w/cm²的激光照射下，rgo-pda@ms的升温速度明显高于氧化石墨烯（go），说明我们所制备的纳米药物传输载体具有良好的光热转化能力，可增强癌症的光动力治疗效果。从图3可看出，如果没有用ha封闭（rgo-pda@ms/ce6），装载在rgo-pda@ms中的ce6在细胞中短时间内几乎全部释放出来，产生泄露现象。经ha封闭后（rgo-pda@ms/ce6/ha），装载在rgo-pda@ms/ce6/ha中的ce6在细胞中基本不泄露；而当用1w/cm²的808nm的激光照射10min时，装载在rgo-pda@ms/ce6/ha中的ce6在细胞中部分释放。图3结果证明我们所研制的rgo-pda@ms/ha肿瘤靶向光热响应药物传输载体具有光热响应特征，可用808nm的光照射控制药物在细胞中的释放。从图4可知，用hoechst33343染色的三种细胞（靶向癌细胞hct-116、靶向癌细胞ht29和正常细胞nih3t3）均呈蓝色荧光（左列），当3种细胞与rgo-pda@ms/ce6/ha作用后，靶向癌细胞hct-116和ht29明显呈现出ce6的红色荧光，而对照组的正常细胞nih3t3没有呈现ce6的红色荧光（中间列），说明rgo-pda@ms/ce6/ha可以靶向识别癌细胞hct-116和ht29并进入靶向癌细胞，而不会对正常细胞进行伤害。从图5可知，相比于对照组（从左开始第1列，标有空白），在没有照射情况下，结合有ce6（从左开始第2列）和rgo-pda@ms/ce6/ha（从左开始第4列）的三种细胞（靶向癌细胞hct-116、靶向癌细胞ht29和正常细胞nih3t3）仍然维持很高的存活率，说明我们的药物传输载体(rgo-pda@ms/ce6/ha)具有优良的生物相容性。而在rgo-pda@ms/ce6/ha存在下，同时用波长为660nm的光（功率为0.05w/cm²）照射5分钟情况下（从左开始第6列），靶向癌细胞hct-116和ht29的成活率降低至15%左右，而正常细胞nih3t3的成活率仍然维持在90%左右，说明我们的药物传输载体(rgo-pda@ms/ce6/ha)可以特异识别癌细胞，并在660nm的光的作用下有效杀死癌细胞。在rgo-pda@ms/ce6/ha存在下，先用808nm的光（功率1w/cm²）照射10分钟，接着再用660nm的光（功率为0.05w/cm²）照射5分钟情况下（最右列），靶向癌细胞hct-116和ht29的成活率降低至5%左右，而正常细胞nih3t3的成活率仍然维持在85%左右，说明我们的药物传输载体(rgo-pda@ms/ce6/ha)不但可以特异识别癌细胞，并在660nm的光的作用下有效杀死癌细胞，而且可以用808nm的光控制药物ce6的释放，并有效把光能转化为热能，增强了癌症的光动力治疗效果。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。