本发明涉及疫苗佐剂制备技术领域，具体是一种新型cpgiss疫苗佐剂的制备方法与应用。
背景技术：
国内众多疫苗生产企业的疫苗佐剂均是用铝佐剂或油佐剂，但该类佐剂有一定的副作用，油乳剂刺激局部产生肉芽肿或炎症反应：铝佐剂可以引起注射部位局部炎症反应进而引起肉芽肿，个别的引起注射对象应激性反应导致个别个体死亡。且诱导的免疫应答是属于th2型的，不足以起到完全的保护动物防感染的作用。虽然能增强体液免疫，抗体以iggⅰ类为主，不能明显地提高细胞介导免疫应答，不能增强细胞免疫，有局限性；还可能对动物体的神经系统造成伤害。主要适用于免疫能力强和可大量生产的抗原。因此制备安全高效的新型疫苗佐剂是非常必要的。
含有特定非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(cpg基序)的寡核苷酸，即cpgiss(cpgimmunostimulatorysequences)是近年发现的被哺乳动物的免疫系统识别为“危险”信号的新型免疫增强剂，能激活人体和许多动物的先天性和适应性免疫系统。在多种动物模型上，已证实cpgiss可作为疫苗佐剂(包括人用疫苗)，而且与传统疫苗相比，可以较大程度减少疫苗抗原的使用量，因而过敏反应的可能性大幅度降低，部分已进入人体的二期临床研究(murad和clay，2009；vollmer和krieg，2009)。
由于cpgiss是一种安全的佐剂，多次动物实验已经证实高达100倍常规剂量的cpgiss注射小鼠未发现明显的急性毒性作用，反复注射cpgiss可为长期预防传染性病原体提供一种安全的方法(klinman等，1999)。cpgiss作为佐剂，可以诱导th1型免疫应答，提升细胞免疫应答的水平，还具有降低疫苗的使用量，减少过敏反应等的优点。
但是，目前尚没有将cpg直接应用到动物的疫苗免疫产品，主要原因在于其存在稳定性不强，时间长存放易降解，导致药效下降；保存条件较苛刻，要求在-20℃下等问题。
现有技术如授权公告号为cn102631675b的中国发明专利，公开了一种高效cpg制剂及其制备方法和应用。cpg制剂中各组分的组成比例为：浓度为10～45μg/ml的cpgiss的pbs溶液80～120ml；白油160～180ml；span-8010～14ml；tween-806～10ml；emulsigen20～40ml。该方法制备cpgiss采用人工合成的方式，成本高且效率低；制备的cpg制剂难以进入细胞，容易被核酸酶降解，从而失去活性。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种能得到极易进入细胞，稳定性好，安全性高，生物相容性好，生物学活性强的新型cpgiss疫苗佐剂的制备方法与应用。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：
本发明采用的菌种被鉴定为巴斯德毕赤酵母（pichiapastoris）保藏号为cgmccno.6368，于2012年7月20号保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（cgmcc）中。
一种新型cpgiss疫苗佐剂的制备方法，制备步骤为：
1）对处于保藏状态的巴斯德毕赤酵母进行活化培养、一级种摇瓶培养和二级种摇瓶培养处理后，将菌种接种到消毒灭菌过的发酵罐中。发酵培养基成份及其重量份为：蔗糖50~60份、酵母粉60~80份、蛋白胨10~15份、尿素30~45份、麦芽汁6~9份、kh2po48~12份、k2hpo4·3h2o5~7份、mgso4·7h2o0.2~0.3份、znso4·7h2o5~7.8份、mnso4·4h2o24~35份、生物素0.016~0.02份、核黄素磷酸钠0.003~0.005份、二十碳五烯酸乙酯0.02~0.06份和去离子水1700~2000份。调节转速和空气流量，控制培养液中溶解氧含量为30~38%；发酵过程中通过流加氨水控制培养液ph为4.6~5.5，培养温度为26~29℃，期间分批补充培养基，11~12.5h后第一次补加培养基，并添加18~22%甘油，15~17h后第二次补加培养基，23~26h后第三次补加培养基，发酵至46~50h。发酵补料培养基成份及其重量份为：蔗糖300~400份、蛋白胨40~60份、mgso4·7h2o10~20份和去离子水1000~1200份。采用上述发酵培养基发酵培养，巴斯德毕赤酵母的增殖速度快，含未甲基化的cpgiss解旋、复制速度快，cpgiss的产量高；采用发酵的方式大量生产cpgiss，成本低廉且安全性高；
2）发酵结束后，将发酵液离心，并收集菌体，离心速率为4500~5800r/min，离心17~23min。用蒸馏水清洗3~5次后，在酵母泥中加入蒸馏水，酵母泥与蒸馏水的料液比为1:3.5~4.6。水浴处理，在95~100℃水浴环境下处理13~17min。处理完后在3~5℃冰浴冷却，并进行超声破碎处理，超声破碎条件为：超声破碎功率为430~460w，破碎时间为17~23min，时间间隔为10：8s/s，过滤，收集滤液；
3）将含金纳米粒子的溶液在3~5℃，11000~13000rpm条件下离心17~23min，金纳米粒子直径为10~20nm，浓度为50~60nm。弃去原来体积7/10~9/10的上清液，沉淀重悬，加入步骤2得到的滤液，使溶液中cpgiss的浓度为2.6~3.4μm。轻轻吹打混合均匀，在23~27℃360~420rpm条件下振荡8~10h，然后缓慢加入0.8~1.2mpbs溶液，溶液中nacl浓度为0.8~1.2m，pb浓度为0.08~0.12m，加入后最终浓度为0.08~0.12m，pbs溶液分5~6次加入，间隔大于30min/次，混合均匀后，在23~27℃360~420rpm条件下振荡22~26h。在3~5℃，12000~14000rpm条件下离心17~23min，弃去全部上清液，并用0.08~0.12m的pbs洗涤3~5次。加入pbs溶液，得到新型cpgiss疫苗佐剂。金纳米粒子尺寸相对均一，免疫原性和细胞毒性很低，生物相容性好；具有很高的比表面积，为iss在其表面修饰并设计形成不同的构型提供了多样的平台；cpgiss-金纳米粒子复合物极易于进入细胞，而且不影响cpgiss的生物学功能；金纳米粒子可以保护其表面上的cpgiss不受核酸酶的降解，最大限度的保持了cpgiss的生物学活性。
一种新型cpgiss疫苗佐剂是动物免疫系统调节剂，用于增强疫苗的免疫原性的用途。
与现有技术相比，本发明的优点在于：1）采用本发明的发酵培养基发酵培养，巴斯德毕赤酵母的增殖速度快，含未甲基化的cpgiss解旋、复制速度快，cpgiss的产量高；2）采用发酵的方式大量生产cpgiss，成本低廉且安全性高；金纳米粒子尺寸相对均一，免疫原性和细胞毒性很低，生物相容性好；3）具有很高的比表面积，为cpgiss在其表面修饰并设计形成不同的构型提供了多样的平台；cpgiss-金纳米粒子复合物极易于进入细胞，而且不影响cpgiss的生物学功能；4）金纳米粒子可以保护其表面上的cpgiss不受核酸酶的降解，最大限度的保持了cpgiss的生物学活性；5）能诱导th1型免疫应答，提升细胞免疫应答的水平，能够增强对疫苗组分抗原特异性的免疫应答，使用本发明疫苗佐剂，能缩短免疫期时间，免疫效果好，在动物养殖生产或人体中应用，提高成活率和免疫保护率。
具体实施例
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
一种新型cpgiss疫苗佐剂的制备方法，制备步骤为：
1）对处于保藏状态的巴斯德毕赤酵母进行活化培养、一级种摇瓶培养和二级种摇瓶培养处理后，将菌种接种到消毒灭菌过的发酵罐中。发酵培养基成份及其重量份为：蔗糖50~60份、酵母粉60~80份、蛋白胨10~15份、尿素30~45份、麦芽汁6~9份、kh2po48~12份、k2hpo4·3h2o5~7份、mgso4·7h2o0.2~0.3份、znso4·7h2o5~7.8份、mnso4·4h2o24~35份、生物素0.016~0.02份、核黄素磷酸钠0.003~0.005份、二十碳五烯酸乙酯0.02~0.06份和去离子水1700~2000份。调节转速和空气流量，控制培养液中溶解氧含量为30~38%；发酵过程中通过流加氨水控制培养液ph为4.6~5.5，培养温度为26~29℃，期间分批补充培养基，11~12.5h后第一次补加培养基，并添加18~22%甘油，15~17h后第二次补加培养基，23~26h后第三次补加培养基，发酵至46~50h。发酵补料培养基成份及其重量份为：蔗糖300~400份、蛋白胨40~60份、mgso4·7h2o10~20份和去离子水1000~1200份。采用上述发酵培养基发酵培养，巴斯德毕赤酵母的增殖速度快，含未甲基化的cpgiss解旋、复制速度快，cpgiss的产量高；采用发酵的方式大量生产cpgiss，成本低廉且安全性高；
2）发酵结束后，将发酵液离心，并收集菌体，离心速率为4500~5800r/min，离心17~23min。用蒸馏水清洗3~5次后，在酵母泥中加入蒸馏水，酵母泥与蒸馏水的料液比为1:3.5~4.6。水浴处理，在95~100℃水浴环境下处理13~17min。处理完后在3~5℃冰浴冷却，并进行超声破碎处理，超声破碎条件为：超声破碎功率为430~460w，破碎时间为17~23min，时间间隔为10：8s/s，过滤，收集滤液；
3）将含金纳米粒子的溶液在3~5℃，11000~13000rpm条件下离心17~23min，金纳米粒子直径为10~20nm，浓度为50~60nm。弃去原来体积7/10~9/10的上清液，沉淀重悬，加入步骤2得到的滤液，使溶液中cpgiss的浓度为2.6~3.4μm。轻轻吹打混合均匀，在23~27℃360~420rpm条件下振荡8~10h，然后缓慢加入0.8~1.2mpbs溶液，溶液中nacl浓度为0.8~1.2m，pb浓度为0.08~0.12m，加入后最终浓度为0.08~0.12m，pbs溶液分5~6次加入，间隔大于30min/次，混合均匀后，在23~27℃360~420rpm条件下振荡22~26h。在3~5℃，12000~14000rpm条件下离心17~23min，弃去全部上清液，并用0.08~0.12m的pbs洗涤3~5次。加入pbs溶液，得到新型cpgiss疫苗佐剂。金纳米粒子尺寸相对均一，免疫原性和细胞毒性很低，生物相容性好；具有很高的比表面积，为cpgiss在其表面修饰并设计形成不同的构型提供了多样的平台；cpgiss-金纳米粒子复合物极易于进入细胞，而且不影响cpgiss的生物学功能；金纳米粒子可以保护其表面上的cpgiss不受核酸酶的降解，最大限度的保持了cpgiss的生物学活性。
一种新型cpgiss疫苗佐剂是动物免疫系统调节剂，用于增强疫苗的免疫原性的用途。
实施例2：
一种新型cpgiss疫苗佐剂的制备方法，最优选步骤为：
1）对处于保藏状态的巴斯德毕赤酵母进行活化培养、一级种摇瓶培养和二级种摇瓶培养处理后，将菌种接种到消毒灭菌过的发酵罐中。发酵培养基成份及其最优选重量份为：蔗糖56份、酵母粉72份、蛋白胨13份、尿素40份、麦芽汁8份、kh2po410份、k2hpo4·3h2o6份、mgso4·7h2o0.25份、znso4·7h2o7.2份、mnso4·4h2o33份、生物素0.019份、核黄素磷酸钠0.005份、二十碳五烯酸乙酯0.04份和去离子水1800份。调节转速和空气流量，控制培养液中溶解氧含量为36%；发酵过程中通过流加氨水控制培养液ph为5.0，培养温度为27℃，期间分批补充培养基，12h后第一次补加培养基，并添加20%甘油，16h后第二次补加培养基，24h后第三次补加培养基，发酵至48h。发酵补料培养基成份及其最优选重量份为：蔗糖380份、蛋白胨50份、mgso4·7h2o15份和去离子水1100份。采用上述发酵培养基发酵培养，巴斯德毕赤酵母的增殖速度快，含未甲基化的cpgiss解旋、复制速度快，cpgiss的产量高；采用发酵的方式大量生产cpgiss，成本低廉且安全性高；
2）发酵结束后，将发酵液离心，并收集菌体，离心速率为5000r/min，离心20min。用蒸馏水清洗4次后，在酵母泥中加入蒸馏水，酵母泥与蒸馏水的料液比为1:4.3。水浴处理，在96℃水浴环境下处理15min。处理完后在4℃冰浴冷却，并进行超声破碎处理，超声破碎条件为：超声破碎功率为450w，破碎时间为20min，时间间隔为10：8s/s，过滤，收集滤液；
3）将含金纳米粒子的溶液在4℃，12000rpm条件下离心20min，金纳米粒子直径为15nm，浓度为56nm。弃去原来体积4/5的上清液，沉淀重悬，加入步骤2得到的滤液，使溶液中cpgiss的浓度为3μm。轻轻吹打混合均匀，在25℃400rpm条件下振荡9h，然后缓慢加入1mpbs溶液，溶液中nacl浓度为1m，pb浓度为0.1m，加入后最终浓度为0.1m，pbs溶液分6次加入，间隔大于30min/次，混合均匀后，在25℃，3400rpm条件下振荡24h。在4℃，13000rpm条件下离心20min，弃去全部上清液，并用0.1m的pbs洗涤4次。加入pbs溶液，得到新型cpgiss疫苗佐剂。金纳米粒子尺寸相对均一，免疫原性和细胞毒性很低，生物相容性好；具有很高的比表面积，为cpgiss在其表面修饰并设计形成不同的构型提供了多样的平台；cpgiss-金纳米粒子复合物极易于进入细胞，而且不影响cpgiss的生物学功能；金纳米粒子可以保护其表面上的cpgiss不受核酸酶的降解，最大限度的保持了cpgiss的生物学活性。
一种新型cpgiss疫苗佐剂是动物免疫系统调节剂，用于增强疫苗的免疫原性的用途。
实施例3：
一种新型cpgiss疫苗佐剂的制备方法，制备步骤为：
1）对处于保藏状态的巴斯德毕赤酵母进行活化培养、一级种摇瓶培养和二级种摇瓶培养处理后，将菌种接种到消毒灭菌过的发酵罐中。发酵培养基成份及其重量份为：蔗糖54份、酵母粉72份、蛋白胨13份、尿素41份、麦芽汁7份、kh2po410份、k2hpo4·3h2o6份、mgso4·7h2o0.2份、znso4·7h2o6.5份、mnso4·4h2o30份、生物素0.017份、核黄素磷酸钠0.003份、二十碳五烯酸乙酯0.04份和去离子水1800份。调节转速和空气流量，控制培养液中溶解氧含量为35%；发酵过程中通过流加氨水控制培养液ph为5.0，培养温度为27℃，期间分批补充培养基，12h后第一次补加培养基，并添加20%甘油，16h后第二次补加培养基，24h后第三次补加培养基，发酵至48h。发酵补料培养基成份及其重量份为：蔗糖350份、蛋白胨50份、mgso4·7h2o17份和去离子水1000份。采用上述发酵培养基发酵培养，巴斯德毕赤酵母的增殖速度快，含未甲基化的cpgiss解旋、复制速度快，cpgiss的产量高；采用发酵的方式大量生产cpgiss，成本低廉且安全性高。核黄素磷酸钠和二十碳五烯酸乙酯能加快德毕赤酵母的增殖速度，并能促进未甲基化的cpgiss进行解旋、复制，增加cpgiss的产量；
2）发酵结束后，将发酵液离心，并收集菌体，离心速率为5000r/min，离心20min。用蒸馏水清洗4次后，在酵母泥中加入蒸馏水，酵母泥与蒸馏水的料液比为1:4.3。水浴处理，在96℃水浴环境下处理15min。处理完后在4℃冰浴冷却，并进行超声破碎处理，超声破碎条件为：超声破碎功率为450w，破碎时间为20min，时间间隔为10：8s/s，过滤，收集滤液；
3）将含金纳米粒子的溶液在4℃，12000rpm条件下离心20min，金纳米粒子直径为15nm，浓度为56nm。弃去原来体积4/5的上清液，沉淀重悬，加入步骤2得到的滤液，使溶液中cpgiss的浓度为3μm。轻轻吹打混合均匀，在25℃400rpm条件下振荡9h，然后缓慢加入1mpbs溶液，溶液中nacl浓度为1m，pb浓度为0.1m，加入后最终浓度为0.1m，pbs溶液分6次加入，间隔大于30min/次，混合均匀后，在25℃，3400rpm条件下振荡24h。在4℃，13000rpm条件下离心20min，弃去全部上清液，并用0.1m的pbs洗涤4次。加入pbs溶液，得到新型cpgiss疫苗佐剂。金纳米粒子尺寸相对均一，免疫原性和细胞毒性很低，生物相容性好；具有很高的比表面积，为cpgiss在其表面修饰并设计形成不同的构型提供了多样的平台；cpgiss-金纳米粒子复合物极易于进入细胞，而且不影响cpgiss的生物学功能；金纳米粒子可以保护其表面上的cpgiss不受核酸酶的降解，最大限度的保持了cpgiss的生物学活性。
一种新型cpgiss疫苗佐剂是动物免疫系统调节剂，用于增强疫苗的免疫原性的用途。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。