本发明涉及一种双酯型乌头碱完全抗原的制备。
背景技术：
乌头碱类二萜生物碱是乌头属植物中主要的活性成分，具有镇痛、消炎、强心和抗癌等药理作用。乌头碱类二萜生物碱主要有3类：单酯型二萜生物碱、双酯型二萜生物碱和脂型二萜生物碱，其中双酯型二萜生物碱的毒性最大，其致毒剂量极小，且治疗量与中毒量接近。在乌头属中药材的生品中双酯型二萜生物碱含量最高，所以生品药用或食用前，都需要通过炮制以减毒增效，提高使用的安全性。生品药的炮制减毒，实际是以水溶去除大部分生物碱和以水解将双酯型生物碱转化为单酯型生物碱的过程，药材来源的差异与炮制过程的控制直接关系到药材的质量评价。快速检测出药物或生物材料中双酯型乌头碱(DAC)的含量，精准把控乌头属中药材应用时的疗效与安全性，一直是乌头属中药材研究中的难点。对于天然产物中含量低的一类物质，在定量分析时也较困难，目前采用的HPLC法或LC—MS法对仪器要求很高，检测时的前期处理工作复杂，检测灵敏度又无法满足痕量检测的要求。相比传统色谱检测方法，基于抗体与抗原或半抗原之间相结合的高度特异性及敏感性而建立起来的免疫分析法，对于微量痕量成分的准确快速检测具有无法比拟的技术优势。在微量痕量中药成分的定性定量分析、中药成分的体内药代动力学研究中，免疫分析法已逐步得到应用，但在中药质量控制领域却鲜有报道。特异性DAc抗体是免疫分析法检测DAC的前提，但目前还没有商品化的特异性DAC抗体。DAC是小分子化合物，具有反应原性，没有免疫原性，只有在与大分子的载体蛋白偶联后才成为完全抗原而具有免疫原性。为此，本研究合成了DAC完全抗原并对其鉴定，以期为DAC免疫学检测方法的建立奠定基础。
技术实现要素：
本发明提出一种双酯型乌头碱完全抗原的制备方法。
一种双酯型乌头碱完全抗原的制备方法，包括以下步骤：
（1）分别精确称取双酯型乌头碱10mg、NHS5mg、EDC5mg，充分溶解于含1mLDMF和200μL双蒸水的溶液中，在室温下避光、搅拌过夜，即为反应液A；
（2）精确称取BSA25mg溶于3mLPBS，调节pH值至7-9；
（3）称取18mgOVA溶于3mLPBS，将pH值调节至7.4，此为反应液B；
（4）将反应液A逐滴加人B中，要求每5～10min加入200μL，在1-2h内操作完毕，然后进行透析，经过离心处理后，纯化后即得。
优选地，所述步骤（2）PH值为7.4。
优选地，所述步骤（4）操作时间为1.5h。
本发明所述方法制备的双酯型乌头碱，抗体的敏感性高、特异性强，本发明所述方法操作简单，可工业化生产，实用性强。
具体实施方式
实施例1。
一种双酯型乌头碱完全抗原的制备方法，包括以下步骤：
（1）分别精确称取双酯型乌头碱10mg、NHS5mg、EDC5mg，充分溶解于含1mLDMF和200μL双蒸水的溶液中，在室温下避光、搅拌过夜，即为反应液A；
（2）精确称取BSA25mg溶于3mLPBS，调节pH值至7-9；
（3）称取18mgOVA溶于3mLPBS，将pH值调节至7.4，此为反应液B；
（4）将反应液A逐滴加人B中，要求每5～10min加入200μL，在1-2h内操作完毕，然后进行透析，经过离心处理后，纯化后即得。
实施例2。
一种双酯型乌头碱完全抗原的制备方法，包括以下步骤：
（1）分别精确称取双酯型乌头碱10mg、NHS5mg、EDC5mg，充分溶解于含1mLDMF和200μL双蒸水的溶液中，在室温下避光、搅拌过夜，即为反应液A；
（2）精确称取BSA25mg溶于3mLPBS，调节pH值至7-9；
（3）称取18mgOVA溶于3mLPBS，将pH值调节至7.4，此为反应液B；
（4）将反应液A逐滴加人B中，要求每5～10min加入200μL，在1-2h内操作完毕，然后进行透析，经过离心处理后，纯化后即得。
本实施例所述步骤（2）PH值为7.4。
实施例3。
一种双酯型乌头碱完全抗原的制备方法，包括以下步骤：
（5）分别精确称取双酯型乌头碱10mg、NHS5mg、EDC5mg，充分溶解于含1mLDMF和200μL双蒸水的溶液中，在室温下避光、搅拌过夜，即为反应液A；
（6）精确称取BSA25mg溶于3mLPBS，调节pH值至7-9；
（7）称取18mgOVA溶于3mLPBS，将pH值调节至7.4，此为反应液B；
（8）将反应液A逐滴加人B中，要求每5～10min加入200μL，在1-2h内操作完毕，然后进行透析，经过离心处理后，纯化后即得。
本实施例所述步骤（2）PH值为7.4；所述步骤（4）操作时间为1.5h。