一种鸭坦布苏病毒、由该病毒制备的疫苗及其制备方法
【专利摘要】本发明公开一种鸭坦布苏病毒、由该病毒制备的疫苗及其制备方法，该病毒命名为鸭坦布苏病毒GDHD2014?3；所述病毒于2016年4月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No：V201621；所述治疗鸭坦布苏病毒的疫苗的制备方法，包括以下步骤：1)病毒培养：将鸭坦布苏病毒GDHD2014?3接种至病毒培养用细胞中，然后收获病毒液并过滤；2)病毒灭活：将病毒液中加入甲醛溶液灭活24～48h；3)乳化：将疫苗原液，与白油佐剂混合进行乳化，获得疫苗；疫苗中的抗原免疫原性好，采用较低浓度病毒制成疫苗即可起到保护作用，保护率达90％以上。CCTCC NO:V20162120160411
【专利说明】
_种鸭坦布苏病毒、由该病毒制备的疫苗及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种鸭坦布苏病毒及其应用。
【背景技术】
[0002] 鸭坦布苏病毒病(Duck Tembusu Virus Strain)，也称蛋鸭黄病毒病是由黄病毒 科鸭坦布苏病毒引起的一种侵害蛋鸭卵巢的急性传染病。主要引起高产蛋鸭产蛋量急剧下 降、采食量急剧下降。如果蛋鸭患此病，其产蛋量可从高峰在一周内迅速下降甚至停产，采 食量也从正常水平降低至正常的20%左右。经临床诊断分析，患病蛋鸭卵巢坏死，脾脏肿 大，并伴有未成形卵的液化等临床病理特征。本病在国内传播广泛，各省种蛋鸭养殖区每年 均有发生。自2010年该病发现以来，从最初的夏季产蛋高峰期爆发发展至现在的不定期发 生，该病呈现出了一种无规律的变化，对蛋鸭养殖业危害极大。此病暂无疫苗上市，因此发 现具有较好免疫原性的毒株对于蛋鸭黄病毒病的疫苗研制，预防该病的发生有重大的意 义。
【发明内容】
[0003] 为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种鸭坦布苏病毒(拉 丁文学名:Duck Tembusu Virus，DTMUV)，该病毒对细胞的适应性强，病毒生产效率高。
[0004] 实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：一种鸭坦布苏病毒，该病毒 命名为鸭坦布苏病毒⑶HD2014-3;所述病毒于201 6年4月11日保藏于中国典型培养物保藏 中心，地址:湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学内，保藏号为CCTCC No: V201621，分类命 名为鸭坦布苏病毒⑶HD2014-3(拉丁文学名：Duck Tembusu vi rus strain ⑶HD2014-3)， 其序列如序列表SEQ No. 1所示。
[0005] 本发明的第二个目的是为了提供一种治疗鸭坦布苏病毒的疫苗，疫苗中的抗原免 疫原性好，小剂量即可起到效果。
[0006] 实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到:一种治疗鸭坦布苏病毒的疫 苗，由上述的鸭坦布苏病毒⑶HD2014-3制备而得。
[0007] 本发明的第三个目的是为了提供一种治疗鸭坦布苏病毒的疫苗的制备方法，可抵 抗发病剂量鸭坦布苏病毒的攻击而保持产蛋率维持在92.4%以上。
[0008] 实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到:如上所述的治疗鸭坦布苏病 毒的疫苗的制备方法，所述的疫苗制备包括以下步骤：
[0009] 1)病毒培养：
[0010]将鸭坦布苏病毒GDHD2014-3接种至含病毒培养用细胞的培养液中，然后收获病毒 液并过滤，-20 °C保存备用；
[0011] 2)病毒灭活：
[0012] 将步骤1)获得的病毒液中加入病毒液体积1000~10000倍体积的甲醛溶液灭活24 ~48h;然后在病毒液中加入硫酸铵，搅匀后在温度为4°C的条件下沉淀6~8h，5000rpm离心 40min，弃上清，沉淀用灭菌双蒸水悬浮，装于透析袋中，于PBS中搅拌透析6~8h，得到纯化 的鸭坦布苏病毒⑶HD2014-3;将病毒lOOOOrpm离心5~lOmin，取上清液为疫苗原液；
[0013] 3)乳化：
[0014]将步骤2)获得的疫苗原液，与白油佐剂混合进行乳化，获得鸭坦布苏病毒 ⑶HD2014-3疫苗。
[0015]作为优选，步骤1)中，所述病毒培养用细胞为ST细胞、Vero细胞或PK15细胞的其中 之一。
[0016] 作为优选，步骤1)中，当培养液的糖分为1~lOmmol，pH值为6.5~7.5时，收获病毒 液。
[0017] 作为优选，步骤2)中，所述硫酸铵的加入质量与病毒液的体积比为:300~400g/L。
[0018] 作为优选，步骤1)中，所述病毒培养的方法为半灌流式培养方法。
[0019] 作为优选，所述半灌流式培养方法包括以下步骤：
[0020] I)采用双臂细胞培养装置进行病毒增殖:将装有载体的双臂细胞培养装置进行高 压灭菌，然后加入培养液，在4~25°C的条件下培养12~36h后置于37°C水浴中20~30min; 无菌接入病毒培养用细胞，在37°C，5%C0 2的条件下进行细胞扩增培养36~120h;
[0021] Π )更换培养液:每天测定培养液中葡萄糖含量以及pH值，当糖分为1~lOmmol时， pH值为6.5~7.5时，进行培养液更换；
[0022] ΙΠ )病毒接种：当病毒培养用细胞数量达到108~101()个时，接入含鸭坦布苏病毒 ⑶HD2014-3的尿囊液，在37°C，5%C02的条件下进行病毒扩增培养；
[0023] IV)补充培养液:接毒后每天进行葡萄糖含量以及pH值监测，当培养液中糖分为1 ~lOmmol时，pH值为6.5~7.5时，收集体积10~90%的鸭坦布苏病毒⑶HD2014-3病毒液，然 后补入等量的新鲜培养液继续培养；
[0024] V)保存:将步骤IV)收获的病毒液于-100~_20°C，反复冻融1~5次，冻融后离心 取细胞碎片、过滤，得到用于接种的鸭坦布苏病毒⑶HD2014-3病毒液，-20°C保存。
[0025] 作为优选，步骤I)中，所述培养液包括体积比1~10%的胎牛血清，体积比1~5% 青链霉素，体积比1~5 %的Η印es液。
[0026]作为优选，重复步骤IV)4~6次，将每次的鸭坦布苏病毒⑶HD2014-3病毒液收集混 合。
[0027]相比现有技术，本发明的有益效果在于：
[0028] 1、本发明提供的鸭坦布苏病毒GDHD2014-3对细胞适应性强，病毒生产效率高；
[0029] 2、本发明所述的疫苗中的抗原免疫原性好，采用较低浓度病毒制成疫苗即可起到 保护作用，保护率达90%以上；
[0030] 3、本发明所述的半灌流式培养方法将鸭坦布苏病毒⑶HD2014-3培养4~6代后，病 毒滴度达到10 7'5ELD5Q/mL，而一般的鸭坦布苏病毒平均需要传代至少30代才可以达到；
[0031] 4、本发明所述的半灌流式培养方法，降低生产成本，提高病毒生产效率，每培养一 批细胞可以连续收获4~6次鸭坦布苏病毒GDH D2014-3病毒液，收获病毒量为普通培养方 式的2.5倍以上，大大降低了病毒的生产成本。
【附图说明】
[0032] 图1为鸭坦布苏病毒⑶HD2014-3的电镜图。
[0033] 本发明所述的鸭坦布苏病毒⑶HD2014-3,于2016年4月11日保藏于中国典型培养 物保藏中心，地址：湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学内，保藏号为CCTCC N〇:V201621， 其序列如序列表SEQ No. 1所示。
【具体实施方式】
[0034]下面，结合附图以及【具体实施方式】，对本发明做进一步描述：
[0035] 一种鸭坦布苏病毒，该病毒命名为鸭坦布苏病毒⑶HD2014-3;所述病毒于2016年4 月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No:V201621，其序列如序列表SEQ No. 1所示。
[0036] 将鸭坦布苏病毒⑶HD2014-3用于疫苗的制备，包括以下步骤：
[0037] 一、病毒培养：
[0038]采用半灌流式培养方法对病毒进行培养，
[0039] I)采用双臂细胞培养装置进行病毒增殖:将装有载体的双臂细胞培养装置进行高 压灭菌，然后加入培养液，在4~25°C的条件下培养12~36h后置于37°C水浴中20~30min; 无菌接入Vero细胞，在37°C，5%C02的条件下进行细胞扩增培养36~120h;
[0040] Π )更换培养液:每天测定培养液中葡萄糖含量以及pH值，当糖分为1~lOmmol时， pH值为6.5~7.5时，进行培养液更换；
[0041] ΙΠ)病毒接种：当Vero细胞数量达到108~101()个时，接入含鸭坦布苏病毒 ⑶HD2014-3的尿囊液，在37°C，5%C0 2的条件下进行病毒扩增培养；
[0042] IV)补充培养液:接毒后每天进行葡萄糖含量以及pH值监测，当培养液中糖分为1 ~lOmmol时，pH值为6.5~7.5时，收集体积10~90%的鸭坦布苏病毒⑶HD2014-3病毒液，然 后补入等量的新鲜培养液继续培养；重复步骤IV ) 4~6次，将每次的鸭坦布苏病毒 ⑶HD2014-3病毒液收集混合；
[0043] V)保存:将步骤IV)收获的病毒液于-100~_20°C，反复冻融1~5次，冻融后离心 取细胞碎片、过滤，得到用于接种的鸭坦布苏病毒⑶HD2014-3病毒液，-20°C保存；
[0044] 所述培养液包括体积比1~10%的胎牛血清，体积比1~5%青链霉素，体积比1~ 5% 的Hepes液。
[0045] 二、病毒灭活：
[0046] 将步骤一获得的鸭坦布苏病毒⑶HD2014-3病毒液中加入病毒液体积1000~10000 倍体积的甲醛溶液灭活24~48h;然后在病毒液中加入质量与病毒液的体积比为：300~ 400g/L的硫酸铵，搅勾后在温度为4°C的条件下沉淀6~8h，5000rpm离心40min，弃上清，沉 淀用灭菌双蒸水悬浮，装于透析袋中，于PBS中搅拌透析6~8h，得到纯化的鸭坦布苏病毒 ⑶HD2014-3;将病毒lOOOOrpm离心5~10min，取上清液为疫苗原液；
[0047] 三、乳化：
[0048] 将步骤二获得的疫苗原液，与白油佐剂混合进行乳化，获得鸭坦布苏病毒 ⑶HD2014-3疫苗。
[0049] 实施例1
[0050] 本实施例用于说明鸭坦布苏病毒⑶HD2014-3的筛选及鉴定：
[0051 ]自2014年在广东省不同市蛋鸭养殖场收集发病蛋鸭卵巢RT-PCR阳性的标本，经处 理后接种至7-9日龄的SPF鸡胚上，培养2天后，在7天内收集死亡的鸡胚，预冷后进行尿囊液 收集，获得鸭坦布苏病毒⑶HD2014-3。
[0052] 对该病毒的基因组序列进行分析，全基因序列如序列表SEQ ID No. 1所示，其与 GenBank中已有的鸭坦布苏病毒的序列相比，核苷酸的同源性在98 %以上。
[0053] 在电镜下观察鸭坦布苏病毒GDHD2014-3,如图1所示，病毒颗粒直径范围在50-150nm，表面有囊膜，囊膜上有纤突，呈四周放射性分布。
[0054]按照《中国兽药典》方法对该病毒进行无菌、支原体检查，结果表明无支原体和其 它微生物污染。
[0055] 实施例2
[0056] 本实施例用于说明半灌流式培养方法对病毒进行培养：
[0057] I)采用双臂细胞培养装置进行病毒增殖:将装有载体的双臂细胞培养装置进行高 压灭菌，然后加入培养液，在25 °C的条件下培养24h后置于37 °C水浴中30min;无菌接入Vero 细胞，在37°C，5%C0 2的条件下进行细胞扩增培养36~120h;
[0058] Π )更换培养液:每天测定培养液中葡萄糖含量以及pH值，当糖分为1~lOmmol时， pH值为6.5~7.5时，进行培养液更换；
[0059] ΙΠ)病毒接种：当Vero细胞数量达到108~101()个时，接入含鸭坦布苏病毒 ⑶HD2014-3的尿囊液，在37°C，5%C0 2的条件下进行病毒扩增培养；
[0060] IV)补充培养液:接毒后每天进行葡萄糖含量以及pH值监测，当培养液中糖分为1 ~lOmmol时，pH值为6.5~7.5时，收集体积40 %的鸭坦布苏病毒⑶HD2014-3病毒液，然后补 入等量的新鲜培养液继续培养;重复步骤IV)6次，将每次的鸭坦布苏病毒GDHD2014-3病毒 液收集混合；
[0061] V)保存：将步骤IV)收获的病毒液于-20°C，反复冻融5次，冻融后离心取细胞碎 片、过滤，得到用于接种的鸭坦布苏病毒⑶HD2014-3病毒液，-20 °C保存；
[0062]所述培养液包括体积比10 %的胎牛血清，体积比5 %青链霉素，体积比5 %的Hepes 液。
[0063] 对获得的鸭坦布苏病毒GDHD2014-3采用鸡胚半数致死率法测定该株病毒的病毒 浓度，方法如下:将SPF鸡胚孵化至7~9天，将病毒用细胞维持液按梯度以10倍系列从ΚΓ1倍 比稀释至ΚΓ 8倍，分别将每个稀释度的病毒液接种100uL/枚，每个稀释度接种6枚蛋，同时设 空白细胞维持液对照组。置37 °C孵化箱中培养鸡胚，2~6天观察细胞感染病毒情况，记录死 亡鸡胚数量，计算病毒浓度，经测定病毒浓度为107' 5ELD5Q/mL。
[0064] 实施例3
[0065]本实施例用于说明疫苗的制备：
[0066]将实施例2中得到的鸭坦布苏病毒GDHD2014-3病毒液中加入病毒液体积的1000倍 体积的甲醛溶液灭活24h;然后在病毒液中加入质量与病毒液的体积比为300g/L的硫酸铵， 搅匀后置于温度为4 °C的条件下沉淀8h，5000rpm离心40min，弃上清，沉淀用灭菌双蒸水悬 浮，装于透析袋中，于PBS中搅拌透析8h，得到纯化的鸭坦布苏病毒GDHD2014-3;将病毒 lOOOOrpm离心10min，取上清液为疫苗原液；
[0067]将疫苗原液，与白油佐剂混合进行乳化，获得鸭坦布苏病毒⑶HD2014-3疫苗。
[0068] 将得到的鸭坦布苏病毒GDHD2014-3疫苗进行产蛋鸭免疫效力试验。将200只产蛋 率为90 %的蛋鸭随机均分为2组，每组100只，免疫组每只注射0.5mL鸭坦布苏病毒 GDHD2014-3疫苗，另外一组注射生理盐水作为空白对照组。疫苗注射后的20天内记录两组 每天产蛋率以及采食量，作为基础产蛋率和基础采食量对照，结果如表1所示。20天后，试验 组和对照组中每只蛋鸭均注射等量的鸭坦布苏病毒⑶HD2014-3进行人工发病，分别记录两 组攻毒后15天内每天产蛋情况，结果如表2所示。
[0069]表1注射疫苗后的产蛋率
[0072]表2进行人工发病后的产蛋率 [0073]
[0070]
[0071]
[0074] ~从表2可以看出，使用本发明鸭坦布苏病毒GDHD2014-3制备的疫苗可抵抗发病剂, 量鸭黄病毒的攻击而保持产蛋率维持在92.4%以上。这一结果表明，使用鸭坦布苏病毒 GDHD2014-3制备的疫苗对于产蛋鸭具有较好的保护效果，可以抵御鸭黄病毒的感染。
[0075] 对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各 种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范 围之内。
【主权项】
1. 一种鸭坦布苏病毒，其特征在于:该病毒命名为鸭坦布苏病毒GDHD2014-3;所述病毒 于2016年4月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No:V201621。2. -种治疗鸭坦布苏病毒的疫苗，其特征在于：由权利要求1所述的鸭坦布苏病毒 ⑶HD2014-3制备而得。3. 如权利要求2所述的治疗鸭坦布苏病毒的疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步 骤： 1) 病毒培养： 将鸭坦布苏病毒GDHD2014-3接种至含病毒培养用细胞的培养液中，然后收获病毒液并 过滤，-20 °C保存备用； 2) 病毒灭活： 将步骤1)获得的病毒液中加入病毒液体积1 〇〇〇~1 〇〇〇〇倍体积的甲醛溶液灭活24~ 48h;然后在病毒液中加入硫酸铵，搅匀后在温度为4°C的条件下沉淀6~8h，5000rpm离心 40min，弃上清，沉淀用灭菌双蒸水悬浮，装于透析袋中，于PBS中搅拌透析6~8h，得到纯化 的鸭坦布苏病毒⑶HD2014-3;将病毒lOOOOrpm离心5~lOmin，取上清液为疫苗原液； 3) 乳化： 将步骤2)获得的疫苗原液，与白油佐剂混合进行乳化，获得鸭坦布苏病毒GDHD2014-3 疫苗。4. 如权利要求3所述的治疗鸭坦布苏病毒的疫苗的制备方法，其特征在于：步骤1)中， 所述病毒培养用细胞为ST细胞、Vero细胞或PK15细胞的其中之一。5. 如权利要求3所述的治疗鸭坦布苏病毒的疫苗的制备方法，其特征在于：步骤1)中， 当培养液的糖分为1~lOmmol，pH值为6.5~7.5时，收获病毒液。6. 如权利要求3所述的治疗鸭坦布苏病毒的疫苗的制备方法，其特征在于：步骤2)中， 所述硫酸铵的加入质量与病毒液的体积比为:300~400g/L。7. 如权利要求3所述的治疗鸭坦布苏病毒的疫苗的制备方法，其特征在于：步骤1)中， 所述病毒培养的方法为半灌流式培养方法。8. 如权利要求7所述的治疗鸭坦布苏病毒的疫苗的制备方法，其特征在于:所述半灌流 式培养方法包括以下步骤： I)采用双臂细胞培养装置进行病毒增殖:将装有载体的双臂细胞培养装置进行高压灭 菌，然后加入培养液，在4~25°C的条件下培养12~36h后置于37°C水浴中20~30min;无菌 接入病毒培养用细胞，在37°C，5%C0 2的条件下进行细胞扩增培养36~120h; Π )更换培养液:每天测定培养液中葡萄糖含量以及pH值，当糖分为1~1 Ommo 1时，pH值 为6.5~7.5时，进行培养液更换； ΙΠ )病毒接种：当病毒培养用细胞数量达到108~101()个时，接入含鸭坦布苏病毒 ⑶HD2014-3的尿囊液，在37°C，5%C02的条件下进行病毒扩增培养； IV) 补充培养液：接毒后每天进行葡萄糖含量以及pH值监测，当培养液中糖分为1~ lOmmol时，pH值为6.5~7.5时，收集体积10~90%的鸭坦布苏病毒⑶HD2014-3病毒液，然 后补入等量的新鲜培养液继续培养； V) 保存:将步骤IV)收获的病毒液于-100~-20°C，反复冻融1~5次，冻融后离心取细 胞碎片、过滤，得到用于接种的鸭坦布苏病毒⑶HD2014-3病毒液，-20 °C保存。9. 如权利要求8所述的治疗鸭坦布苏病毒的疫苗的制备方法，其特征在于：步骤I)中， 所述培养液包括体积比1~10 %的胎牛血清，体积比1~5 %青链霉素，体积比1~5 %的 Hepes液。10. 如权利要求8所述的治疗鸭坦布苏病毒的疫苗的制备方法，其特征在于：重复步骤 IV)4~6次，将每次的鸭坦布苏病毒⑶HD2014-3病毒液收集混合。
【文档编号】A61P31/14GK106085965SQ201610395224
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月3日 公开号201610395224.6, CN 106085965 A, CN 106085965A, CN 201610395224, CN-A-106085965, CN106085965 A, CN106085965A, CN201610395224, CN201610395224.6
【发明人】冯晓声, 王伟, 王贵平, 罗梦萍
【申请人】广东海大畜牧兽医研究院有限公司