一种快速诊断坦布苏病毒的胶体金试纸条的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及预防兽医学检验领域，具体涉及了一种快速诊断坦布苏病毒的胶体金 试纸条。
【背景技术】
[0002] 坦布苏病毒感染是我国于2010年新发生的一种传染性疾病，2010年春夏之交，江 浙地区突然出现鸭产蛋下降，之后迅速波及福建、广东、广西、安徽、江苏、江西、河南、山东、 河北和北京等地的鸭场，经过病原分离和系统的实验室诊断，该病的病原为黄病毒属中的 坦布苏病毒（Tembusuvirus，TMUV) 〇
[0003] 本病夏秋季发生更严重，蛋鸭、肉鸭生产区均有发生；本病危害多个品种，包括 蛋鸭中的绍兴鸭、缙云麻鸭、山麻鸭、金定鸭、康贝尔鸭、台湾白改鸭，肉种鸭中的樱桃谷鸭 和北京鸭，野鸭等；该病发病率高，死亡率较低，一般在5%以下，有继发感染时也可高达 30%。10~25日龄肉鸭和产蛋鸭更易感。鹅、鸡也有发病的报道。该病一年四季均可发 生，但夏秋季节多发，冬季也能发生。雏鸭、育成鸭感染该病后以病毒性脑炎为特征，病鸭瘫 痪，站立不稳，行走时双脚向外叉开、呈八字脚、头部振颤、走路时容易翻滚、腹部朝上、两腿 呈游泳状挣扎。病鸭腹泻，排白绿稀便，有的还排褐色粪便，脱水、蹼干燥。严重病例者采食 困难，痉挛倒地不起，两腿向后踢蹬最后衰竭死亡。产蛋鸭以产蛋下降为特征，鸭突然发病， 大群鸭精神尚好，采食下降，粪便稀薄、变绿。产蛋鸭采食量突然下降，较正常鸭采食下降约 40 %~50%，体温升高，精神沉郁，排绿色稀便，部分鸭瘫痪，个别鸭出现精神沉郁，流泪，喙 出血等症状。2~3天后，产蛋量急剧下降，在1~2周内，产蛋率从80%~90%或90%以 上下降至10%以下，每日降幅可达5%~20%，30~35天后广蛋率逐渐恢复。因此，该病 造成了养禽业巨大的经济损失，严重影响和制约了养禽业的发展。
[0004] 坦布苏病毒的基因组核酸为单股正链RNA，其分子量大小约为10. 5Kb左右，病毒 的基因组长度为10990个核苷酸。黄病毒基因组是由5'非编码区（5'non-codingregion， NCR)，3' 非编码区（3'untranslatedregion，UTR)及一个开放性阅读框（openreading frame，0RF)组成。病毒的基因组开放阅读框（0RF)编码一个多聚蛋白，由3426个氨基酸 构成，可以裂解为3个结构蛋白（E、C、M蛋白）和7个非结构蛋白（NS1，NS2A，NS2B，NS3， NS4A，NS4B，NS5)。黄病毒基因组RNA具有感染性，并且携带所有遗传信息，在病毒复制增殖 的过程中，具有mRNA作用。因此该病毒基因组既可以复制下一代RNA，也可以翻译出该病毒 的蛋白。坦布苏E蛋白为黄病毒主要的结构蛋白，其在病毒吸附、组装及病毒与被侵染宿主 的细胞膜融合过程中起到重要的作用；E蛋白也是黄病毒的主要抗原，含有多种类型的抗 原表位，这些抗原表位可以诱发机体产生保护性的免疫应答，并使机体产生中和性抗体。
[0005]目前，针对鸭坦布苏病毒已建立的检测方法主要是分子生物学检测方法，如套式 RT-PCR、LAMP、地高辛、荧光定量PCR等方法；血清学方法诸如间接ELISA和双抗体夹心 ELISA方法检测坦布苏病毒的相关报道。虽然普通的分子生物学检测方法检测特异性较好， 诊断灵敏度高，但是耗时时间甚长，耗材昂贵，不适合基层检测。血清学检测方法较分子生 物学方法耗时较短，操作较为简便，但由于其存在较大的非特异性而容易存在假阳性问题， 从而影响对疾病的诊断，因此，迫切需要研发一种更简便、快速地对大量样品进行TMUV的 检测的方法。
【发明内容】
[0006] 针对现有技术存在的空白，本发明提供了一种快速诊断坦布苏病毒的胶体金试纸 条，包括PVC底板，所述的底板一端设置有样品垫，样品垫的一端通过金标垫与硝酸纤维素 膜相连接，硝酸纤维素膜的另一端与吸水垫相连接，所述的金标垫上包被有抗坦布苏病毒 E蛋白单克隆抗体一一胶体金标记物，所述的硝酸纤维素膜上设置有一条包抗坦布苏病毒E 蛋白单克隆抗体的检测区和一条包被羊抗鼠二抗的对照区，采用这种结构的试纸条具有特 异性强，操作简便、快速，结果显示直观、准确，减少投资和检测成本，应用范围广等优点，能 广泛应用于基层对于样品的检测。
[0007] 本发明所采用的具体技术方案是：
[0008] 发明人首先获得了抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体A12D3和C12D1，其中抗坦布苏 病毒E蛋白单克隆抗体A12D3和C12D1是分别通过杂交瘤细胞（CCTCCC201546)和（CCTCC C201547)获得的；
[0009] 所述的杂交瘤细胞是通过纯化的坦布苏病毒E蛋白作为免疫抗原免疫的小鼠脾 细胞与SP2/0骨髓瘤细胞采用PEG融合法进行细胞融合以及后续有限稀释法亚克隆所获得 的；
[0010] 利用上述的抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体A12D3,发明人将其与胶体金混合制 备获得了抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体A12D3-胶体金标记物，并将其作为包被物制备 获得了金标垫；
[0011] 同时发明人利用抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体C12D1包被于检测区，羊抗鼠二 抗包被于对照区；
[0012] 利用上述的金标垫、检测区和对照区，发明人进一步的设计并制造了对应的试纸 条，所述试纸条包括PVC底板，所述的底板一端设置有样品垫，样品垫的一端通过金标垫与 硝酸纤维素膜相连接，硝酸纤维素膜的另一端与吸水垫相连接，所述的金标垫上包被有抗 坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体A12D3-胶体金标记物，所述的硝酸纤维素膜上设置有一条 包被有抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体C12D1的检测区和一条包被羊抗鼠二抗的对照区。 [0013]与现有技术相比，本发明的试纸条中采用了抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体一胶 体金标记物和抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体对样品进行检测，特异性高，且操作简便、快 速，结果显示直观、准确，减少投资和检测成本，较之现有采用的各种检测方法更加快捷，且 不需要特殊仪器设备，更适合于基层临床样品检测。
[0014] 利用上述的试纸条，可用来检测鸭泄殖腔内容物或喉头粘液等可能含有坦布苏病 毒的样品，将上述样品用试纸条进行检测，当检测区和对照区均出现红色条带时，证明样品 感染了坦布苏病毒；若仅有对照区出现红色条带，则证明样品未感染坦布苏病毒；若没有 红色条带出现，则考虑该试纸条失效。
[0015] 综上所述，采用这种结构的试纸条具有特异性强，操作简便、快速，结果显示直观、 准确，减少投资和检测成本，应用范围广等优点，能广泛应用于基层对于样品的检测。
[0016] 保藏信息
[0017] 保藏时间：2015年7月12日
[0018] 保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心CCTCC
[0019] 保藏编号：CCTCCNO:C2〇l546
[0020] 保藏单位地址：中国武汉大学
[0021] 分类命名：杂交瘤细胞株A12D3
[0022] 保藏时间：2015年7月12日
[0023] 保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心CCTCC
[0024] 保藏编号：CCTCCNO:C2〇l547
[0025] 保藏单位地址：中国武汉大学
[0026] 分类命名：杂交瘤细胞株A12D1
【附图说明】
[0027] 图1为本发明所述试纸条的结构示意图；
[0028] 图中1为样品垫，2为金标垫，3为检测区，4为对照区，5为硝酸纤维素膜，6为吸水 垫，7为PVC底板；
[0029] 图2为不同稀释度的坦布苏病毒尿囊液检测结果灰度图，
[0030] 其中1:1，1:10, 1:50, 1:100, 1:1000分别为病毒尿囊液稀释度，下面的红线为检 测区红线。
【具体实施方式】
[0031] 实施例1
[0032] -种快速诊断坦布苏病毒的胶体金试纸条，包括PVC底板7,所述的底板7 -端 设置有样品垫1，样品垫1的一端通过金标垫2与硝酸纤维素膜5相连接，硝酸纤维素膜 5的另一端与吸水垫6相连接，所述的金标垫2上包被有抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体 A12D3-胶体金标记物，所述的硝酸纤维素膜5上设置有一条包抗坦布苏病毒E蛋