果斑病菌免疫胶体金检测试纸条及其单抗和杂交瘤细胞株的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程领域，尤其涉及一种瓜类细菌性果斑病菌，具体来说是一种 瓜类细菌性果斑病菌免疫胶体金快速检测试纸条及其单抗和杂交瘤细胞株。
【背景技术】
[0002] 瓜类果斑病是一种严重的细菌性病害，20世纪80年代后期该病因在美国数个 州的西瓜上出现破坏性爆发而受到广泛关注，自此，瓜类细菌性果斑病在世界范围内传播 开来。其病原为革兰氏阴性菌的嗜酸菌属燕麦种西瓜亚种（Acidovorax avenae subsp. citrulli，Aac)，是一种具有高度破坏性的种传病菌。到目前为止，并无可以完全抵抗该病 菌的商业化的培育品种。
[0003] 瓜类果斑病菌又称果斑病菌，它可以引起西瓜、甜瓜、南瓜等萌芦科植物患病，据 报道，在番茄、茄子等茄科植物的种子中也检测到了该病原菌，它可侵染果实、植株及种子， 主要依靠带菌种子传播。带菌种子播种后会使幼苗患病，出现褐色坏死斑。带菌果实在采 后贮藏运输过程中会感染健康果实，表面会出现水渍状斑点，最终导致整个果实腐烂，严重 影响瓜类产量。
[0004] 目前市场上用于检测果斑病菌的试纸是来自美国Agdia公司，国内报道较少，且 现有技术中的免疫胶体金试纸条所使用的抗体往往是使用单克隆抗体作为金标抗体和多 克隆抗体作为检测抗体配合使用，因此存在着检测精度低和交叉反应高、试纸条有效期短 等问题，对检测的精度和准确度造成了一些影响。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种瓜类细菌性果斑病菌免疫胶 体金快速检测试纸条，所述的这种瓜类细菌性果斑病菌免疫胶体金快速检测试纸条解决了 现有技术中的试纸条检测瓜类细菌性果斑病菌灵敏度不高的技术问题。
[0006] 本发明提供了一种瓜类细菌性果斑病菌免疫胶体金快速检测试纸条，包括样品 垫、紧密连接于所述样品垫的金标垫、所述的金标垫上与所述金标垫紧密连接的纤维素膜 和紧密连接于所述纤维素膜另一端的吸水垫，所述的纤维素膜上远离金标垫的一端设置 质控线，在质控线和金标垫之间的纤维素膜上设置检测线，其中，在所述的金标垫上设置 有与胶体金耦联的单克隆抗体，所述的单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO. 10413的杂交瘤 细胞株分泌产生，所述的检测线由单克隆抗体构成，所述的单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO. 10413的杂交瘤细胞株分泌产生。
[0007] 进一步的，所述的质控线由羊抗鼠抗体组成。
[0008] 进一步的，在所述的胶体金耦联的单克隆抗体中，单克隆抗体与胶体金在质量体 积比为24 y g: lmL。
[0009] 进一步的，所述的试纸条背面可设置一个起支撑作用的背板。
[0010] 进一步的，所述的试纸条装入一个盒体中，所述的盒体对应于样品垫的部位设有 检测孔，对应于检测线和质控线的部位设有观测窗。
[0011] 本发明还提供了一种单克隆抗体，由保藏号为CGMCC NO. 10413的杂交瘤细胞株分 泌产生。
[0012] 本发明还提供了一种杂交瘤细胞株，其保藏号为CGMCC NO. 10413。
[0013] 本发明的一种杂交瘤细胞株，分类命名：抗瓜类细菌性果斑病菌（Acidovorax avenae subsp. citrullii)杂交瘤细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心（CGMCC)中，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为：北京市 朝阳区北辰西路1号院（中科院微生物研宄所），保藏日期为2015年3月19日，保藏号为 CGMCC NO. 10413。
[0014] 本发明的检测原理与结果判断过程为：若样本中有待测细菌，测定时样品处理液 加在样品垫上，样品处理液按样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫的方向移动，流经金标 垫时，使金标垫上的与胶体金耦联的单克隆抗体复溶，并带动其向硝酸纤维素膜、吸水垫移 动，与胶体金耦联的单克隆抗体可与样品中的细菌结合，形成免疫复合物，此免疫复合物流 至检测线时，即被检测线的单克隆抗体所捕获，形成细菌+金标抗体+抗体的复合体，在硝 酸纤维素膜上的检测线位置显出红色检测线条；此免疫复合物流经质控线时，即被质控线 的固相抗体所捕获，在硝酸纤维素膜上的质控线位置显出红色质控线条。
[0015] 阳性标本既显示检测线，又显示质控线；阴性标本没有检测线，仅显示质控线。
[0016] 本发明人的研宄表明，以西瓜斑菌菌株作为免疫原，免疫Balb/c小鼠，分离纯化 得到保藏号为CGMCC NO. 10413的杂交瘤细胞株，纯化后的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体 的效价可达到1:12800,其能够特异性、高效地与8种西瓜斑菌菌株结合，与3种Aac近缘植 物病原菌均无交叉反应。
[0017] 本发明和已有技术相比较，其技术进步是显著的。本发明的果斑病菌的免疫胶体 金检测试纸条，由于采用了新筛选的配对单克隆抗体分别喷涂金标垫和检测线，实验结果 表明，对果斑病菌的检测特异性和灵敏性均较高。
【附图说明】
[0018] 图1是本发明实施例中果斑病菌的免疫胶体金检测试纸条的单抗SDS-PAGE电泳 图。
[0019] 图2是本发明实施例中果斑病菌的免疫胶体金检测试纸条的腹水及纯化后抗体 效价，其中2A表示腹水抗体的效价，2B表示纯化后抗体的效价。
[0020] 图3是本发明实施例中果斑病菌的免疫胶体金检测试纸条的各抗体偶联胶体金 pH结果。
[0021] 图4是本发明实施例中果斑病菌的免疫胶体金检测试纸条的各抗体偶联胶体金 结合量结果。
[0022] 图5是本发明实施例中果斑病菌的免疫胶体金检测试纸条的结构示意图。
[0023] 图6是本发明实施例中果斑病菌的免疫胶体金检测试纸条的各抗体组合配对结 果。
[0024] 图7是本发明实施例中果斑病菌的免疫胶体金检测试纸条的胶体金试纸条灵敏 度结果。
[0025] 图8是本发明实施例中果斑病菌的免疫胶体金检测试纸条的胶体金试纸条检测8 种果斑病菌及交叉反应结果，其中8a表示试纸条检测8种果斑病菌的检测结果，8b表示试 纸条检测3种Aac近缘植物病原菌的检测结果。
【具体实施方式】
[0026] 以下结合附图介绍本发明的【具体实施方式】：
[0027] 首先介绍本发明实施例中所使用的试剂与仪器：
[0028] 主要试剂：
[0029] PEG、TWEEN-20来自Sigma ;BSA来自上海世泽生物科技有限公司；胶体金溶液来自 上海金标生物科技有限公司；硝酸纤维素膜（NC膜）135S来自Millipore ;羊抗鼠、HRP-羊 抗鼠、羊抗兔来自生工生物工程股份有限公司。
[0030] 主要仪器：
[0031] 酶标仪SpectraMaxM2 购自MolecularDevices;Nanodrop2000C购自Thermo Scientific;点样仪AD6010购自BIO-DOT;扫描仪PhantomV9购自MICROTEK;恒温培养摇 床SPH-100B购自上海世平；蛋白纯化仪BioLogic?LP358BR5057购自BIO-RAD;单人净化 工作台SW-SJ-2D型购自苏州净化。
[0032] 实施例1果斑病菌单克隆抗体制备
[0033] 1.免疫原准备
[0034] 8种西瓜斑菌菌株先在脑心浸液液体培养基进行增菌培养，后在其固体培养基划 线，挑单菌落于脑心浸液液体培养基中培养后进行PCR鉴定，并测定600nm处0D值，选取生 长较快一株作为免疫菌株。灭菌生理盐水离心重悬3次，并调整菌浓度为10 8CFU/mL。
[0035] 2.单克隆抗体的制备过程
[0036] 1)实验动物：选3只8周龄，体重20g左右、雌性Balb/c小鼠为实验动物。
[0037] 2)免疫方法：每只小鼠腹腔注射0. 4mL免疫原，每间隔2周用同样剂量加强注射 一次。
[0038] 3)采血：3次加强免疫后从尾部静脉采血，采用间接非竞争酶联免疫法测定抗血 清效价。待效价不再上升，腹腔注射同样量免疫原，3天后按照常规方法进行细胞融合。
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