一种检测青霉噻唑酸的免疫胶体金试纸条及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种快速检测牛奶中青霉素降解物的方法，特别是一种检测青霉噻唑 酸的免疫胶体金试纸条及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 目前，关于乳及乳制品的安全问题的报道日渐增多，其中比较突出的问题即牛奶 中的抗生素残留，特别是青霉素类抗生素的残留。青霉素类抗生素由于价廉、高效、低毒广 泛用于治疗奶牛和其他动物疾病。然而由于使用和操作的不规范导致青霉素类抗生素残留 现象十分严重。一些不法商贩向牛奶中掺加内酰胺酶使牛奶中残留的青霉素降解，主 要产物为青霉噻唑酸，造成"无抗奶"假象从而逃避安全检测。然而研宄发现，青霉素致敏 反应时主要的抗原决定簇是青霉噻唑蛋白。青霉素极易降解成青霉噻唑酸，在体内与组织 蛋白结合形成青霉噻唑蛋白，引发速发型过敏反应。
[0003] 目前国内外对青霉素检测的研宄比较多，但世界各国针对青霉素降解产物的检测 方法的报道却很少。传统方法有碘量法、高效液相色谱法等，而且这些方法各有其优缺点， 但都操作复杂不能实现青霉素降解物的现场快速检测。目前关于青霉噻唑酸胶体金免疫层 析试纸条分析方法未见相关报道。
[0004] 胶体金免疫层析技术（GoldImmunochromatographyAssay，GICA)是二十世纪八、 九十年代在酶联免疫分析方法的基础上发展的新型快速免疫检测技术。该技术操作简单快 速、结果容易判定、安全无污染等诸多优点使其在世界各国应用十分广泛，成为体外快速诊 断领域发展的趋势性方法。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明创造旨在提出一种检测青霉噻唑酸的免疫胶体金试纸条。
[0006] 为达到上述目的，本发明创造的技术方案是这样实现的：
[0007] 一种检测青霉噻唑酸的免疫胶体金试纸条，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、 吸水垫和PVC背板，在PVC背板上按顺序依次粘附有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水 垫；所述的结合垫上包被有青霉噻唑酸抗体一胶体金标记物；所述的硝酸纤维素膜上分别 包被有青霉噻唑酸抗原构成的检测线e和羊抗兔二抗构成的质控线，两条线间隔距离为 5mm〇
[0008] 本发明还公开了上述免疫胶体金试纸条的制备方法，包括如下步骤：
[0009] (1)青霉噻唑酸抗血清纯化，得到青霉噻唑酸多克隆抗体；
[0010] (2)制备青霉噻唑酸抗原；
[0011] (3)采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金；
[0012] (4)将步骤（1)纯化的抗体加入到步骤（3)制备的胶体金中，制备青霉噻唑酸抗 体一胶体金标记物；
[0013] (5)将步骤（4)制备的青霉噻唑酸抗体一胶体金标记物包被于结合垫上；（6)将步 骤（2)制备的青霉噻唑酸抗原包被在硝酸纤维素膜上构成检测线，并将羊抗兔二抗包被于 硝酸纤维素膜上构成质控线；
[0014] (7)在PVC背板上按顺序依次粘附样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，得到所 述的青霉噻唑酸胶体金免疫层析试纸条。
[0015] 上述材料中样品垫和硝酸纤维素膜购自美国Millipore公司，结合垫、吸水垫和 PVC背板购自上海金标生物科技公司。
[0016] 本发明纯化了青霉噻唑酸抗血清，得到了青霉噻唑酸多克隆抗体，备用。制备青霉 噻唑酸抗原作为检测线的包被抗原，采用购买的羊抗兔二抗作为质控线的捕获抗体。利用 竞争法来检测青霉噻唑酸，根据检测线条带的深浅判断待测样品中是否含有青霉噻唑酸。 若质控线条带无颜色，则该试纸条失效。
[0017] 与现有国内外检测青霉噻唑酸的方法相比，本发明具有以下突出的优点：1、本发 明的青霉噻唑酸胶体金免疫层析试纸条是利用抗原抗体的特异性反应实现的，因此特异性 高，灵敏度好。2、本发明的检测试纸条检测时间快速（10分钟）且不需要任何特殊仪器、设 备，检测成本低。3、本发明的检测试纸条操作简便，不需由专业人员操作。4、本发明的检测 试纸条储存方便，在室温下可保存2个月。
【附图说明】
[0018] 构成本发明创造的一部分的附图用来提供对本发明创造的进一步理解，本发明创 造的示意性实施例及其说明用于解释本发明创造，并不构成对本发明创造的不当限定。在 附图中：
[0019] 图1为本发明检测试纸条的组装示意图。
[0020] 图2为检测结果的判定。
[0021] 图3为青霉素降解物试纸条特异性的确定（从左至右：空白，青霉噻唑酸、青霉素、 氯霉素、三聚氰胺、四环素、沙丁胺醇、诺氟沙星、氧氟沙星、磺胺喹噁啉、磺胺甲氧嗪，青霉 噻唑酸浓度为100yg/L，其他药物浓度均为1000yg/L)。
[0022] 图4为青霉噻唑酸检测限的确定（青霉噻唑酸的浓度从左到右分别为0、5、10、 50yg/L)
[0023] 图5为青霉噻唑酸试纸条在室温下的稳定性。（a)室温放置两周，（b)室温放置四 周，（c)室温放置六周，（d)室温放置八周。每组青霉噻唑酸的浓度分别为0、10、50yg/L。
[0024] 图6为添加BPA的牛奶样品检测结果（青霉噻唑酸的浓度从左到右分别为0、10、 50、100yg/L)〇
[0025] 图7为添加BPA的奶粉样品检测结果（青霉噻唑酸的浓度从左到右分别为0、40、 100、200yg/kg)〇
[0026] 附图标记说明：
[0027] 1、样品垫、2、结合垫、3、硝酸纤维素膜、4、吸水垫
[0028] 5、检测线、6、质控线、7、PVC板
【具体实施方式】
[0029] 需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明创造中的实施例及实施例中的特征可 以相互组合。
[0030] 下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明创造。
[0031] 实施例1(制备实施例）
[0032](一）青霉噻唑酸抗血清的纯化
[0033] 本实验所用青霉噻挫酸抗血清由实验室自制，采用ProteinA-Sepharose4B作 亲合层析介质纯化青霉噻唑酸抗血清，可一次性获得接近纯度较高的特异性抗体。具体操 作步骤为（1)平衡：用平衡缓冲液（〇.2mol/L的磷酸缓冲液）冲洗管路，平衡柱子，至基线 平稳。（2)上样：用平衡缓冲液将青霉噻唑酸特异性抗血清等体积稀释后上柱。（3)洗杂： 用平衡缓冲液洗杂至杂蛋白的紫外吸收峰出现后继续冲洗至基线平稳。（4)洗脱收集：用 0.lmol/LpH2. 7的甘氨酸缓冲液洗脱特异性IgG抗体。当紫外吸收曲线呈上升趋势，收集 特异性抗体。并迅速用Tris-HCl中和抗体至中性。（5)封柱：抗体收集完成后迅速用醋酸 缓冲液酸化纯化柱后，用平衡缓冲液中和纯化柱，最后用20%乙醇饱和封柱。将纯化收集的 抗体，用PH7. 4的磷酸缓冲液4°C透析三天后取出，添加0.1 % (w/v)的叠氮钠，用磷酸缓冲 液将浓度稀释成lmg/mL，备用。利用该抗体与胶体金结合制备青霉噻唑酸抗体一胶体金标 记物。
[0034](二）青霉噻唑酸抗原的制备
[0035] 采用活化酯法制备青霉噻唑酸抗原。称取IOmg青霉噻唑酸、5mgNHS和IOmgEDC 粉末，分别加至试管中，加入200yL0.01m〇l/L磷酸盐缓冲液（pH5.7)溶解混合后置于旋 涡混合器上振荡至试管中出现浑浊，再加入5mgEDC，置于摇床上反应5h。将上述反应液取 出置于离心管中，3000rpm，4°C离心l_2min，将上清取出，即活化酯液。
[0036]称IOmg鸡卵白蛋白（OVA)溶于2mL 0? Olmol/L磷酸盐缓冲液（pH5. 7)，冰浴下加 入反应液后4°C过夜反应，反应产物于pH7. 4的磷酸盐缓冲液（PBS)中4°C透析三天，然后 精确量取反应溶液的体积，测定浓度后，加入0.1 % (w/v)的叠氮钠，4°C保存备用。
[0037] 利用该抗原包被硝酸纤维素膜上的检测线。
[0038] 实施例2(制备实施例）
[0039] 青霉噻唑酸胶体金免疫层析试纸条组装及制备方法
[0040] 1、试纸条组装：
[0041] 本发明的试纸条组成如下：样品垫1、结合垫2、硝酸纤维素膜3、吸水垫4和PVC板 8,在PVC板8上按顺序依次粘附有样品垫1、结合垫2、硝酸纤维素膜3、吸水垫4 ;所述的结 合垫2上包被有青霉噻唑酸抗体一胶体金标记物；所述的硝酸纤维素膜3上分别包被有青 霉噻唑酸抗原构成的检测线5和羊抗兔二抗构成的质控线6。