检测犬恶丝虫抗体胶体金免疫层析试纸条及制备方法
【专利摘要】本发明提供一种检测犬恶丝虫抗体胶体金免疫层析试纸条及制备方法，其特点在于：利用胶体金标记的金黄色葡萄球菌A蛋白制作本发明的金标抗体，即金标垫；再利用犬恶丝虫MTFP蛋白，作为诊断抗原包被硝酸纤维膜（NC膜），作为检测线（T线），兔抗SPA抗体作为质控线(C线)，以上为基础研制出本发明夹心法检测犬恶丝虫血清抗体的胶体金免疫层析试纸条。本发明具有方便快捷、试验结果肉眼可见，不需要特殊实验仪器，不需专业技术人员操作等特点，更适合基层单位现场检测。具有高特异性，高敏感性，本发明利用犬恶丝虫的重组蛋白MTFP作为诊断性抗原，比全蛋白提高了检测的特异性；又采用金黄色葡萄球菌A蛋白作为金标蛋白，由于其可以与抗体的Fc段发生特异性结合，两者的夹心结合既保证了本发明试纸条的特异性又保证了敏感性。
【专利说明】
检测犬恶丝虫抗体胶体金免疫层析试纸条及制备方法
技术领域
[0001]本发明提供一种检测犬恶丝虫血清抗体的胶体金试纸条检测方法，利用胶体金免疫层析技术检测犬血清内的恶丝虫抗体，属于免疫学检测技术领域。
【背景技术】
[0002]犬恶丝虫病在我国几乎各地均有发生，该病不仅可引起犬、狐猝死，还能严重影响狐的毛皮质量，造成严重的经济损失，并且已成为潜在的严重威胁人类健康的新发人兽共患传染病病而受到广泛关注和重视，迄今为止，该病仍没有理想的诊断治疗方法。
[0003]犬恶丝虫MTFP基因编码肌球蛋白马达域，即Π型肌球蛋白。作为细胞骨架的分子马达，是一种多功能蛋白质，其主要功能是为肌肉收缩提供动力。与编码马来丝虫肌球蛋白尾家族蛋白部分序列同源性为88%。已有研究表明MTFP编码的蛋白具有良好的免疫原性和反应原性，是诊断犬恶丝虫较好的诊断性抗原。目前，国内外未见利用MTFP蛋白作为诊断抗原建立的胶体金免疫层析试纸条检测方法。
【发明内容】
[0004]
本发明的目的是公开一种高特异性、高灵敏度、方便快捷的检测犬恶丝虫血清抗体的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法，适合于临床诊断及大规模的流行病学调查。
[0005]本发明所述的检测犬恶丝虫抗体胶体金免疫层析试纸条及制备方法，其特点在于:利用胶体金标记的金黄色葡萄球菌A蛋白制作本发明的金标抗体，即金标垫;再利用犬恶丝虫MTFP蛋白，作为诊断抗原包被硝酸纤维膜(NC膜)，作为检测线(T线)，兔抗SPA抗体作为质控线(C线)，以上为基础研制出本发明夹心法检测犬恶丝虫血清抗体的胶体金免疫层析试纸条。其中:
一、重组蛋白MTFP的克隆、表达及纯化
1、引物的设计与合成根据目的基因序列，设计两对引物:
F2:5 ’ -GGATCCCAACTTACGCAGGAAGCA- 3 ’，下划线为 BamH I 酶切位点；
S2:5 ’-CTCGAGCTCGAGTTAGCAGTAATTGATGCC- 3 ’，下划线为 Xho I 酶切位点。
[0006]2、目的基因的扩增
以含有MTFP插入片段的噬菌体基因组作为模板进行PCR扩增，PCR产物进行凝胶回收。
[0007]3、目的基因与PMD18-T克隆载体的连接
将纯化的PCR产物与pMD18-T克隆载体连接。之后进行连接产物的转化及阳性克隆的鉴定。
[0008]4、目的片段与pGEX-4T-l载体的连接与转化
将鉴定为阳性的重组质粒PMD18-T-MTFP进行凝胶回收，与pGEX_4T_l载体进行连接，再转化至BL21感受态，然后进行酶切鉴定及测序鉴定。
[0009]5、目的基因的原核表达
将表达菌活化后，S%qIPTG诱导表达4h之后，收集菌体进行SDS-PAGE，结果表明MTFP蛋白主要以包涵体的形式表达。
[0010]6、重组蛋白MTFP的纯化
将菌体沉淀超声破碎，利用SM尿素法进行纯化，首先用2M尿素反复清洗，最后将蛋白沉淀溶于8M尿素中。经Western blot验证该蛋白可被犬恶丝虫阳性血清识别。
[0011]7、重组蛋白的透析复性
利用梯度透析的方法对纯化的MTFP蛋白进行透析复性，目的是将其中的尿素去除，以用于下一步划膜。
[0012]二、胶体金试纸条的组装
首先，将包被好检测线和质控线的21mm硝酸纤维素膜粘贴到PVC底板上，再取24mm样品垫、9mm金标垫、32mm吸水纸从下到上依次重叠2mm粘贴于PVC底板上;依次粘贴好后，将试纸板上的各种耗材与PVD底板压紧，用切纸机将组装好的试纸板切成每条宽度为4mm的试纸条即可。
[0013]本发明的积极效果在于:
本发明具有方便快捷、试验结果肉眼可见，不需要特殊实验仪器，不需专业技术人员操作等特点，更适合基层单位现场检测。具有高特异性，高敏感性，本发明利用犬恶丝虫的重组蛋白MTFP作为诊断性抗原，比全蛋白提高了检测的特异性;又采用金黄色葡萄球菌A蛋白作为金标蛋白，由于其可以与抗体的Fe段发生特异性结合，两者的夹心结合既保证了本发明试纸条的特异性又保证了敏感性。重复性好，保存期长，4°情况下可保存60天以上。
【附图说明】
[0014]图1试纸条组装示意图；
图2金标抗体透射电镜图；
图3试纸条特异性试验结果示意图；
图4试纸条灵敏性试验结果示意图。
【具体实施方式】
[0015]下列实施例旨在进一步举例说明本发明的具体方法及应用性，而不是限制本发明。
[0016]实施例1
胶体金免疫层析试纸条检测方法的建立
(I)胶体金标记SPA的鉴定
取金标SPA溶液与透射电镜下观察其状态，主要包括:大小是否相等、形状是否均匀一致、有无聚集情况，金颗粒周围有无蛋白晕等，从而鉴定金标抗体的标记效果。
[0017](2)金标垫的选择
本发明选用4种金标垫分别是聚酯纤维VL68、玻璃纤维RB45、聚酯纤维VL78、聚酯纤维VL98，首先分别滴加金标抗体，观察四种金标垫对金标抗体的吸收情况，以及干燥之后金标抗体在四种金标垫上的分布情况，边缘效应等。
[0018](3) NC膜上C线抗体包被浓度的确定
将C线抗体稀释成1、0.5、0.25、Omg/ml，每个试纸条包被Iul，T线蛋白包被浓度为Img/ml，包被lul，按照常规条件进行操作，观察结果C线的显色情况，确定C线抗体的最佳包被浓度。
[0019](4) NC膜上T线蛋白包被浓度的确定
将T线蛋白稀释成1、0.5、0.25、Omg/ml，每个试纸条包被Iul，C线抗体包被浓度为Img/ml，包被lul，按照常规条件进行操作，观察结果T线的显色情况，确定T线蛋白的最佳包被浓度。
[0020]、结果
(I)胶体金标记SPA的鉴定
在透射电镜下观察，发现颗粒大小基本相等，约在40nm左右，形状较为均一，无聚集现象，分散较好，且胶体金颗粒周围存在一圈明显的蛋白晕，表明金标SPA标记成功(见图2)。
[0021](2)金标垫的选择
结果表明金标SPA在玻璃纤维RB45上分布的更加均匀，边缘效应较小，以玻璃纤维RB45为金标垫的金标抗体释放更为完全，所以选择玻璃纤维RB45为本试验组装试纸条的金标垫。
[0022](3) NC膜上C线抗体包被浓度的确定
将C线抗体稀释成0、0.25、0.5、lmg/ml，当抗体浓度在0.5mg/ml时，C线显色清晰均勾，而0.25mg/ml时显色较淡，不清晰，故选择0.5mg/ml为C线抗体包被浓度。
[0023](4) NC膜上T线蛋白包被浓度的确定
将T线蛋白稀释成O、0.25、0.5、lmg/ml，当蛋白浓度在lmg/ml时，T线显色较为清晰均勾，而0.5mg/ml时T线几乎没有显色，故选择lmg/ml为T线蛋白包被浓度。
[0024]实施例2、胶体金免疫层析试纸条性能测试
对试纸条耗材以及T/C线包被量选择完成之后，将试纸条进行组装，为了检测试纸条的工作性能，要对试纸条进行一系列的测试，其中包括特异性试验、灵敏度试验、稳定性试验(稳定性试验中包括重复性试验)。
[0025](I)特异性试验
分别取犬蛔虫阳性血清，犬等孢球虫阳性血清作对照，犬心丝虫阴性血清作为阴性对照，按照上述建立的胶体金试纸条方法进行操作，观察试纸条显色情况，从而评价试纸条的特异性。
[0026](2)灵敏性试验
将犬心丝虫阳性血清进行倍比稀释(1:1,1:2,1:4,1:8,1:16,1:32),按常规操作观察试纸条显色情况。当用肉眼无法观察到T线，并且C线依旧清晰可见时，此时的稀释度即为该方法的最低检出浓度。
[0027](3)稳定性试验
一次性制备试纸条18只，分三个批次，于4°C密封保存。分别在I天、I月、2月这三个时间点，每个时间点取出6只分别对同一阴性样品、同一阳性样品进行3次重复检测，观察三个重复试纸条的显色情况，从而判断试纸条检测的稳定情况。
[0028](4)试纸条检测阳性血清符合率试验应用已经建立的胶体金试纸条检测方法，对11份辽宁省丹东市犬心丝虫参照阳性血清进行检测，根据检出的阳性样品数，评价该方法检测结果与实际阳性血清的符合率。
[0029](5)试纸条的初步应用
应用所组装的试纸条对62份犬血清样品进行检测，观察试纸条显色情况，计算犬心丝虫的的阳性感染率。
[0030]、结果
(I)特异性试验
结果表明犬蛔虫阳性血清与犬等孢球虫阳性血清的T检测线均无显色，表明该试纸条与犬蛔虫，犬等孢球虫阳性血清均无交叉反应，说明此方法的特异性良好(见图3)。
[0031](2)灵敏性试验
当犬心丝虫阳性血清稀释到32倍时，试纸条的T线几乎不能看见，而C线显色清晰，当犬心丝虫阳性血清稀释到16倍时，试纸条的T线与C线显色都较为清晰，说明该方法的最低检出线为1:16(见图4)。
[0032](3)稳定性试验
结果表明I个月和2个月的T线、C线条带清晰度没有I天的检测结果明显，颜色明显变淡，金标垫的释放性也相对较差，但仍然可以指示正确的结果，说明根据本试验得到结果显示该试纸条至少可以保存2个月以上。且3个重复的结果和T、C线的显色效果较为一致，说明重复性较好。
[0033](4)试纸条检测阳性血清符合率试验
对犬心丝虫标准阳性血清的检测结果表明，犬心丝虫胶体金试纸条检测方法对11份已知的犬心丝虫阳性血清检测均表现为阳性，即阳性符合率为100%。
[0034](5)试纸条的初步应用
利用组装好的试纸条对62份犬血清进行检测，检测的结果为4份阳性，58份阴性，阳性率为6.4%。
【主权项】
1.一种检测犬恶丝虫抗体胶体金免疫层析试纸条，其特征在于:主要包括玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜、吸水纸、PVC底板;金标垫为利用胶体金标记金黄色葡萄球菌A蛋白制作的金标抗体;利用犬恶丝虫MTFP蛋白作为诊断抗原包被硝酸纤维膜(NC膜)作为检测线(T线);兔抗SPA抗体作为质控线(C线)。2.如权利要求1所述的一种检测犬恶丝虫抗体胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特点在于: 重组蛋白MTFP的克隆、表达及纯化: I)引物的设计与合成 根据目的基因序列，设计两对引物: F2:5 ’ -GGATCCCAACTTACGCAGGAAGCA- 3 ’，下划线为 BamH I 酶切位点； S2:5 ’-CTCGAGCTCGAGTTAGCAGTAATTGATGCC- 3 ’，下划线为 Xho I 酶切位点； 2)目的基因的扩增 以含有MTFP插入片段的噬菌体基因组作为模板进行PCR扩增，PCR产物进行凝胶回收； 3)目的基因与PMD18-T克隆载体的连接 将纯化的PCR产物与pMD18-T克隆载体连接。3.之后进行连接产物的转化及阳性克隆的鉴定； 4)目的片段与pGEX-4T-l载体的连接与转化 将鉴定为阳性的重组质粒PMD18-T-MTFP进行凝胶回收，与pGEX-4T-l载体进行连接，再转化至BL21感受态，然后进行酶切鉴定及测序鉴定； 5)目的基因的原核表达 将表达菌活化后，S%qIPTG诱导表达4h之后，收集菌体进行SDS-PAGE，结果表明MTFP蛋白主要以包涵体的形式表达； 6)重组蛋白MTFP的纯化 将菌体沉淀超声破碎，利用SM尿素法进行纯化，首先用2M尿素反复清洗，最后将蛋白沉淀溶于8M尿素中；经Western blot验证该蛋白可被犬恶丝虫阳性血清识别； 7)重组蛋白的透析复性 利用梯度透析的方法对纯化的MTFP蛋白进行透析复性，目的是将其中的尿素去除，以用于下一步划膜； 胶体金试纸条的组装: 首先，将包被好检测线和质控线的21mm硝酸纤维素膜粘贴到PVC底板上，再取24mm样品垫、9mm金标垫、32mm吸水纸从下到上依次重叠2mm粘贴于PVC底板上;依次粘贴好后，将试纸板上的各种耗材与PVD底板压紧，用切纸机将组装好的试纸板切成每条宽度为4mm的试纸条即可。
【文档编号】G01N33/68GK105929178SQ201610363379
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年5月30日
【发明人】张西臣, 姜鑫, 侯洪烈, 高珺珊, 李建华, 宫鹏涛, 杨举, 李 赫, 李棕松, 杨正涛, 尹继刚
【申请人】吉林大学