尿液胱抑素c半定量检测胶体金试纸的制作方法
【专利摘要】尿液胱抑素C半定量检测胶体金试纸，包括塑料底板和依次粘贴在底板上的样液吸收部分、胶体金标记部分、检测反应部分及吸水部分。所述样液吸收部分为滤纸或玻璃纤维膜，所述胶体金标记部分包括玻璃纤维膜及其上标记的物质CysC单克隆抗体1，所述检测反应部分包括硝酸纤维素膜及其上具有一条截留带、三条检测带和质控带，其中，检测带T1?T4结合有精确定量的CysC单克隆抗体2，质控带包被羊抗鼠IgG，所述吸水部分为滤纸或玻璃纤维膜。本发明的积极效果是能实现家庭检测和现场检测，具有特异性高，检测程序简单，结果准确可靠，提供了一种简便、直观、快捷地对尿页样品中CysC进行半定量的检测方法。
【专利说明】
尿液胱抑素C半定量检测胶体金试纸
技术领域
[0001]本发明属于医疗器械，具体涉及一种尿液胱抑素C(CysC)半定量检测胶体金试纸。
【背景技术】
[0002]现阶段，患糖尿病、高血压、高血脂等所谓“富贵病”的人越来越多，但人们发现这些患者病情逐渐恶化甚至死亡的原因并不是糖尿病、高血压等诸多疾病，而是肾病。大量研究证实，肾小管损伤在肾损伤中具有重要的意义，所以如能肾小管的损伤及早诊断和治疗，预防肾功能不全的发生发展，将对治愈患者疾病、控制疾病恶化、延长患者寿命有着举足轻重的作用。
[0003]半胱氨酸蛋白酶(Cystatin)是一种淀粉生成酶，主要存在于小动脉壁，产生淀粉样物质。而Cystatin C是半胱氨酸蛋白酶的细胞外抑制剂，对细胞内蛋白的转换起作用。Cystatin C是一种分子量为13.359KD的小分子蛋白属管家基因，在所有有核细胞都可以表达，并且表达不受感染、炎症、饮食、体重以及肝功能变化的影响，它在体内唯一的代谢途径是通过肾脏排泄，并且在肾小管上皮细胞内完全降解。人体内主要分布在细胞外液如:脑脊液、血液、精液、唾液、尿液、胸水、羊水、关节液、泪液等，在细胞内主要分布于神经细胞、甲状腺细胞、胰岛细胞等。在脑脊液中浓度最高，尿液中最低，提示其合成部位主要在中枢神经系统。
[0004]当近端肾小管功能失常时，会阻碍CystatinC从肾小球超滤后的重吸收，同时尿中Cystatin C浓度将增加100倍之多，94%Cyst C从肾脏清除，肾外清除部分小于0.34ml/min，表明循环中Cyst C几乎完全从肾小球滤过Cyst C与肌酐相比有很多生理优点。总的说来，在肾小管没有严重受损情况下，Cyst C是不会直接从血液中进入肾小管，说明Cyst C是评价肾小管损伤的内源性标志物。
[0005]2006年曹华军、王旭等采用胶乳增强免疫比浊法测定尿中的Cystatin C，同时采用速率散射比浊法测定尿中微量白蛋白、α?微球蛋白、免疫球蛋白G、转铁蛋白。实验证明:尿cystatin C是肾脏疾病时肾小管损伤的敏感指标。
[0006]2010年，陈红等对高血压肾病患者进行相关研究，发现尿Cystatin C是判断高血压肾病患者肾小管受损的早期敏感指标。
[0007]胶体金是一种常用的标记技术，是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术，有其独特的优点。近年已在各种生物学研究中广泛使用。在临床使用的免疫印迹技术几乎都使用其标记。
[0008]1971年Faulk和Taytor将胶体金引入免疫化学，此后免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法，在生物医学各领域得到了日益广泛的应用。目前在医学检验中的应用主要是免疫层析法(immunochromatogra-phy )和快速免疫金渗滤法(Dot-1mmuogo Idfiltrat1n assay DIGFA)，用于检测蛋白质、激素、药物和抗双链DNA抗体等，具有简单、快速、准确和无污染等优点。
[0009]目前医学检验中应用的免疫胶体金快速检测技术主要有CGEIA和DIGFA两种方法。这两种方法都是以微孔滤膜为载体，包被已知抗原或抗体，加入待检标本后，经滤膜的毛细管作用或渗滤作用使标本中的抗原或抗体与膜上包被的抗体或抗原结合，再用胶体金结合物标记而达到检测目的。
[0010]CGEIA是20世纪90年代初在免疫渗滤技术的基础上建立的一种简易快速的检测技术，由Beggs M等最先用于人绒毛膜促性腺激素(human chor1nic gonadothphin，HCG)的测定。免疫层析条主要由玻璃纤维膜、金标垫、硝酸纤维膜，纤维膜组成，将4种膜从底部向上按顺序粘在支持物上并切成条即成。检测时，只需将层析条插入待检液中，平放在桌面上，5min后观察结果即可。试验原理以最常用的双抗体夹心测抗原为例，当将层析条插入待检液中进行检测时，含有待测抗原的液体从免疫层析条的底部被吸收后迅速与金标探针(Abl-Au)发生抗原抗体反应，形成的抗原抗体复合物(Abl-Au-Ag)通过毛细作用被运送到上面的硝酸纤维膜上，复合物接着与硝酸纤维膜上的抗体发生反应，形成另一个复合物(Abl-Au-Ag-Ab2)而富集在检测区，由于胶体金自身显色而形成红色的质控线。该方法由于简便、快速、特异性、敏感性好，结果直观等优点，得到了空前广泛的发展和应用。
[0011]与其他检测技术比较，应用免疫胶体金快速检测技术时，样品不需要特殊处理，试剂和样本用量极小，样本量可低至ILL?2LL;既可用于抗原检测，也可用于抗体检测，检测时间大大缩短，也不需荧光显微镜、酶标检测仪等贵重仪器，试验结果可长期保存。但该技术一般作为定性，不易定量，大批量的集约性的操作，不如ELISA快而方便。胶体金免疫测定时，当标本中受检物浓度超过试剂的敏感度时出现显色的阳性反应。这种测定较适用于检测正常体液中不含有的或含量极低而疾病时明显升高的物质，例如感染性疾病病原体的抗原或其相应抗体，妊娠时尿液中HCG等。但目前还未见在尿液CysC半定量检测中使用。
【发明内容】
[0012]本发明的目的是提供一种尿液胱抑素C半定量检测胶体金试纸，通过对检测区显色条带数目来判定尿液中CysC是否高于正常水平，从而实现了肾小管损伤的预警作用及早期辅助诊断。克服现有技术存在的前述不足。
[0013]本发明的胶体金试纸包括塑料底板和依次粘贴在底板上的样液吸收部分、胶体金标记部分、检测反应部分及吸水部分；
[0014]所述样液吸收部分为滤纸或玻璃纤维膜，检测时起吸收样品溶液的作用，便于样品溶液向上移动。
[0015]所述胶体金标记部分包括玻璃纤维膜及其上标记的物质CysC单克隆抗体I。
[0016]所述检测反应部分包括硝酸纤维素膜及其上具有一条截留带、三条检测带和质控带，其中、检测带T1-T4结合有精确定量的CysC单克隆抗体2，质控带包被羊抗鼠IgG。依据显色条带数目来判断肾小管损伤程度。
[0017]所述吸水部分为滤纸或玻璃纤维膜，用于引流样品溶液。
[0018]本发明的原理是玻璃纤维膜上包被一定量金标CysC单克隆抗体I，当尿液中CysC含量低于正常量时，尿液中的CysC首先与金标单抗I结合，S卩CysC+金标单抗I复合物将随同尿液在膜上运行至检测带Tl，与其上精确定量的正常量的CysC单克隆抗体2发生结合，检测带Tl显色，检测带Tl显色，T2不显色，砸标单抗I继续随同尿液在膜上运行至质控带，质控带显色，此时为阴性结果。当尿液中CysC含量高于正常量时，CysC与胶体金标记的单抗I结合，SPCysC+金标单抗I复合物将随同尿液在膜上运行至检测带I，与其上精确定量的正常量的CysC单克隆抗体2发生结合，检测带Tl显色，多余的CysC+金标单抗I复合物会与检测带T2-T4上的CysC单克隆抗体2发生结合，检测带T2—T4根据CysC多余程度显色，金标单抗I继续随同尿液在膜上运行至质控带，质控带显色，此时为阳性结果，并通过T2-T4显色条带多少大致确定肾小管损伤程度。
[0019]本发明的积极意义和效果在于:本发明的尿液CysC半定量检测胶体金试纸通过金标试剂的免疫层析作用进一步实现了对临床检测更有意义的半定量检测。检测全过程在10分钟内判定结果，可以方便地实现家庭检测和现场检测，具有特异性高，检测程序简单，结果准确可靠，操作人员无需专业培训，按说明书指导即可得到检测结果，从而有助于肾小管损伤的早期诊断和改善，还可以实现肾小管损伤的及时监测与跟踪。
[0020]使用Cysc半定量试纸条检测尿液中Cysc含量[0021 ]采样:收集新鲜尿液即可。
[0022]检测:将试纸条放平，用一次性吸头吸取0.1ml的尿液，滴加至样品垫吸收部分，5?10分钟后肉眼观察结果。
[0023]观察:如果检测带I显色，检测带2不显色，质控带显色，为阴性结果，表明尿液中CysC的含量低于1.5yg/ml，正常。检测带I显色，检测带2显色，质控带显色，为阳性结果，表明尿液中0}^(]的含量高于1.548/1]11，但低于5(^8/11^，为轻微患病。检测带1显色，检测带2、3显色，质控带显色，为阳性结果，表明尿液中CysC的含量高于50yg/ml，但低于100yg/mL，为中度患病。检测带I显色，检测带2、3、4显色，质控带显色，为阳性结果，表明尿液中CysC的含量不低于200yg/ml，为重度患病。检测带I和质控带均不显色，表明试纸条失效。
【附图说明】
[0024]图1为本发明结构的正面示意图。
[0025]I是样液吸收部分、2是胶体砸标记部分、3是检测反应部分，由检测带Tl、检测带T2、质控带C组成;4是吸水部分。
[0026]图2为本发明试纸条所配备的尿液滴管示意图
[0027]图3为本发明的使用结果说明图。图3中a检测带I显色，检测带2不显色，质控带显色，为阴性结果，表明尿液中CysC的含量低于1.5yg/ml，正常。图3中b检测带I显色，检测带2显色，质控带显色，为阳性结果，表明尿液中CysC的含量高于1.5yg/ml，但低于50yg/mL，为轻微患病。图3中c检测带I显色，检测带2、3显色，质控带显色，为阳性结果，表明尿液中CysC的含量高于50yg/ml，但低于100yg/mL，为中度患病。图3中d检测带I显色，检测带2、3、4显色，质控带显色，为阳性结果，表明尿液中CysC的含量不低于200yg/ml，为重度患病。图3中e检测带I和质控带均不显色，表明试纸条失效。
【具体实施方式】
[0028]实施例尿液胱抑素C半定量检测胶体金试纸
[0029]1.胶体金溶液的制备
[0030]在反应器中加入0.01%氯金酸，煮沸后加入0.01%的柠檬酸三钠，待颜色稳定停止加热，然后进行光谱扫描，以510?560nm间出现最大吸收峰为宜，收集产物备用。[0031 ] 2.半定量检测CysC胶体金试纸的制备及装配
[0032]2.1胶体金标记部分的制备和处理:
[0033]将CysC单克隆抗体I加入胶体金溶液，终浓度至5ug/ml，混勾，使其形成CysC单克隆抗体1-胶体金聚合物。
[0034]2.1.1待标记CysC单克隆抗体I的预处理
[0035]将CysC单克隆抗体I预先在0.00511101/1他(:1，？!17.0溶液中4°(:透析过夜，除去多余的电解质，然后6500?13000r/min 4°C离心60min，去除沉淀，调整蛋白质浓度至2mg/mL即可用于标记。
[0036]优化胶体金标记CysC单克隆抗体I的实验条件:
[0037]调整pH值:用0.2molK2C03将胶体金溶液调至8.2;通过目测法确定CysC单克隆抗体I的最适用量比:取胶体金溶液分装至离心管中(Iml)，向其中加入不同量CysC抗体I，迅速混匀，然后，各加入200yL10 %NaCl溶液，摇匀，静置5min后观察各管。根据胶体金显色区分，颜色未发生改变的最低蛋白量，为最适标记浓度。
[0038]2.1.2抗体金探针的制备
[0039]当单抗的最适稳定量及标记的最佳pH值被确定以后便可进行标记。具体步骤如下:
[0040]根据用以标记的胶体金的总量计算出所需要的待标记单抗的总量;在电磁搅拌下，将单抗溶液加入胶体金溶液中，单克隆抗体大约5min加完;30min后在磁性搅拌下加入10 %的牛血清白蛋白(BSA)使其终浓度为0.5%；继续搅拌5min，加入10 %聚乙二醇20000(PEG20000)溶液使其终浓度为0.05%。制成的溶液即为胶体金标记的CysC单克隆抗体I溶液，测量体积备用。
[0041 ] 2.1.3抗体金探针的纯化
[0042]将胶体金标记CysC单克隆抗体I溶液以4°C、5000r/min，离心30min，留下部分胶体金，定容至原体积的I /I O，4 0C保存备用。
[0043]2.1.4胶体金标记CysC单克隆抗体I部分处理
[0044]将纯化好的胶体金标记CysC单克隆抗体I溶液倒入一槽中，将玻璃纤维纸浸入Imin，取出，室温干燥或真空冷冻干燥，即为胶体金标记部分。
[0045]2.2检测反应部分处理
[0046]用胶体金划膜仪包被4条单克隆抗体2作为检测带Τ1-Τ4，Τ1_Τ4为2yg的单克隆抗体2，质控带包被羊抗鼠IgG，即为检测反应部分。
[0047]2.3半定量检测CysC胶体金试纸的装配
[0048]在塑料底板上依次粘贴样液吸收部分、胶体砸标记部分、检测反应部分和吸水部分，即为半定量检测Cy SC胶体金试纸。
【主权项】
1.尿液胱抑素C半定量检测胶体金试纸，包括塑料底板和依次粘贴在底板上的样液吸收部分、胶体金标记部分、检测反应部分及吸水部分； 所述样液吸收部分为滤纸或玻璃纤维膜， 所述胶体金标记部分包括玻璃纤维膜及其上标记的物质CysC单克隆抗体I， 所述检测反应部分包括硝酸纤维素膜及其上具有一条截留带、三条检测带和质控带，其中、检测带T1-T4结合有精确定量的CysC单克隆抗体2，质控带包被羊抗鼠IgG， 所述吸水部分为滤纸或玻璃纤维膜。
【文档编号】G01N33/577GK105929175SQ201610285527
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年5月3日
【发明人】彭龙, 郭凤云, 张军, 杨文魁, 王宝泉, 王瀚
【申请人】长春圣金诺生物制药有限公司