一种半定量检测α-葡聚糖的胶体金试纸条及检测方法
【技术领域】
[0001 ]本发明设及一种半定量检测a-葡聚糖的胶体金试纸条及检测方法。
【背景技术】
[0002] 日-葡聚糖(dextran)又称右旋糖酢，是一类D-化喃葡萄糖的聚合物的总称，通过a-1，6糖巧键形成主链，少量的支链部分则由a-1，2, Q-I，3和a-l，4糖巧键形成。分子 式为（C出10〇5) n，分子量一般由数万到数百万，从可溶性小分子到不可溶的高分子，呈胶粘 状，粘度随分子量和浓度的增加而增加。Q-葡聚糖呈白色粉末状，无臭、无味，通常可溶于 水、薦糖溶液、氯化钢溶液中，溶解性随分子量和浓度的增加而下降。不溶于乙醇，常溫稳 定，加热逐渐变色或分解。用稀酸水解后，得部分解聚产物;若长时间水解，可得葡萄糖。右 旋糖酢经碱性降解反应，产物的粘度随水解时间的长短而显著不同。Q-葡聚糖是最早发现 的微生物多糖，是世界上第一个工业化生产的微生物多糖，也是美国FDA批准的第一种可 用于食品的微生物胞外多糖。
[0003] 在甘薦制糖生产过程中出现的a-葡聚糖，俗称"薦饭"。新鲜甘薦中a-葡聚糖的含 量很少，几乎为零。但甘薦如受到刀伤或压伤、病虫害、火烧、霜冻或在收割后放置长时间， 就会受到肠膜明串珠菌化euconostoc mesnteroides)、链球菌属（Sheptococcus)等微生 物的感染而形成葡聚糖。运些微生物在适宜的溫度和湿度下，能够分泌葡聚糖薦糖酶 (dextransucrose)，催化薦糖生成葡萄糖并聚合而生成多糖体，从而产生a-葡聚糖。从薦汁 到精制产品，制糖工艺过程自始至终存在着Q-葡聚糖引起的不良影响。薦汁中Q-葡聚糖的 存在意味着糖分转化损失，粘度增大，澄清、过滤、蒸发、煮糖(结晶）、分蜜受影响，收回降 低，成本增加，产品质量下降，影响产品的适用性。因此，O-葡聚糖的监测成为糖厂生产控制 的一个重要技术。
[0004] 制糖工业中a-葡聚糖的测定一般可用化ze^CUMSA法、Robed' S铜法、Potical Activity Ltd.DASA法、酶解法等，但运些方法都有较大的局限性，如准确度不高、操作繁 琐、不适用所有糖品等缺点。其中测定Q-葡聚糖的两个主流方法，HAZE法和Robeds方法，或 者基于运两种原理的衍生方法，都属于化学测定法。运两种测试方法都要利用到O-葡聚糖 在酒精溶液中沉淀的特性。Q-葡聚糖的运些定量测定方法在长期W来的应用中存在可靠 性、精确性、特异性均不高，价格昂贵和操作繁琐费时的缺点。而高效液相色谱法，则存在着 仪器设备要求高，测试时间长，样本处理难的问题。
[0005] 胶体金免疫层析技术作为一种检测技术，其特点是方便快捷，除少量试剂外无需 任何仪器设备，几分钟即可肉眼观察结果。胶体金试纸条的样品前处理简单，抗干扰能力 强，能满足分析要求，适用于大量样品的定性和半定量初筛。本发明的半定量检测O-葡聚糖 的胶体金试纸条具有化ISA方法的高灵敏度，大幅降低检测成本。对于在制糖行业中便捷、 准确检测原料、中间物料、产品及副产品中的O-葡聚糖是很有意义的。检索结果表明，尚未 有半定量检测O-葡聚糖浓度的方法，也没有利用胶体金法对O-葡聚糖进行半定量检测的报 道。
【发明内容】
[0006] 为了克服现有技术中所存在的不足，本发明的目的在于提供一种半定量检测a-葡 聚糖的胶体金试纸条及检测方法。
[0007] 本发明所采取的技术方案是： 一种半定量检测O-葡聚糖的胶体金试纸条，包括底板，底板上依次相连的样品垫、金标 垫、反应膜W及吸样垫，在金标垫上包被有胶体金标记的抗a-葡聚糖的单克隆抗体或抗a-葡聚糖的多克隆抗体;所述反应膜位于金标垫一端设有检测区，远离金标垫一端设有质控 区，所述检测区上设置了 1条或多条互相平行的检测线，检测线上包被有抗Q-葡聚糖的单克 隆抗体或抗O-葡聚糖的多克隆抗体。
[0008] 所述质控区设置有质控线，质控线上包被有羊抗鼠抗体IgG。
[0009] 所述抗a-葡聚糖的单克隆抗体的制备方法为： 1) 将Q-葡聚糖与蛋白混合，用水溶解，冷冻干燥，研磨成粉； 2) 将粉末置于50~60°C的恒溫，反应至少3天，得到a-葡聚糖-蛋白交联物； 3) 将a-葡聚糖-蛋白交联物与佐剂混合，乳化，注射到动物体内； 4) 选取血清效价高的动物体，取其脾细胞制成悬液，并与对数生长期的瘤细胞混合，介 导融合、筛选得到可W分泌O-葡聚糖特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株； 5) 使用杂交瘤细胞生产得到a-葡聚糖特异性单克隆抗体或使用腹水法生产得到a-葡 聚糖特异性单克隆抗体。
[0010] 作为优选的，所述蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白中的一种。
[0011] 作为优选的，所述a-葡聚糖的分子量在10~2000kDa。
[0012] 作为优选的，所述抗a-葡聚糖的单克隆抗体由杂交瘤细胞株D9分泌得到，所述杂 交瘤细胞株D9已于2010年12月7日保藏于中国典型培养物保藏中屯、，保藏编号为CCTCC NO: C2010107。
[OOU] -种检测a-葡聚糖的试剂盒，包括外盒体和盒内支架，其特征在于:所述盒内支架 上设置有试纸条凹槽可放置胶体金试纸条。
[0014] 作为优选的，所述盒内支架上还设置有若干试剂管孔，孔内放置有试剂管，试剂管 中分别盛装的试剂包括O-葡聚糖标准品溶液、样品稀释液。
[0015] 本发明半定量检测a-葡聚糖的胶体金试纸条的原理是：用胶体金标记抗a-葡聚糖 的单克隆抗体，将该金标抗体包被于金标垫上。在检测线上包被有一定量的抗Q-葡聚糖的 单克隆抗体。当将待检样品到达金标垫后，若样品中含有O-葡聚糖，则与胶体金标记的抗体 结合，形成抗原抗体胶体金标记复合物。该复合物泳动到检测线时会被检测线的抗O-葡聚 糖的单克隆抗体所捕获，形成双抗体夹屯、复合物，聚集在检测线上而显色。若样品中所含的 a-葡聚糖低于一定的量，则形成复合物后泳动到检测线时形成的双抗体夹屯、复合物过少， 不能够在检测线显色。
[0016] 通过在试纸条上设置多条间隔的检测线，可W实现a-葡聚糖的半定量检测。制作 该试纸条时，通过限定各检测线上包被的抗体量，使得每条检测线能够结合一定量的抗原 抗体胶体金标记复合物。距离胶体金垫由近到远，检测线显色时所代表的a-葡聚糖含量依 次增加。根据检测结果中出现检测线的数量，判断样品中O-葡聚糖的浓度范围。
[0017] 本发明的胶体金检测试纸条特异性强、灵敏度高、操作简便，能够实现对a-葡聚糖 快速检测。
【附图说明】
[0018] 图1为本发明胶体金试纸条结构示意图（1为样品垫，2为金标垫，3为反应膜，4为检 测线，5为质控线，6为吸样垫）； 图2为检测结果示意图（a-葡聚糖浓度小于5ng/ml); 图3为检测结果示意图（a-葡聚糖浓度为5-20ng/ml); 图4为检测结果示意图（a-葡聚糖浓度为20-5化g/ml); 图5为检测结果示意图（a-葡聚糖浓度大于50ng/ml)。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0020] 实施例1 : a-葡聚糖金标检测试纸的制备方法 1.胶体金的制备： 采用巧樣酸S钢还原法制备胶体金。取50ml O.lmg/ml的氯金酸溶液，100 r/min揽 拌，加热至沸腾，加入2ml lOmg/ml巧樣酸钢溶液，保持原有的反应溫度和揽拌速度，继续沸 腾反应5min，至溶液颜色刚刚变为清亮橘红色后停止反应。冷却，并置于栋色瓶中4°C避光 保存。经电镜检测，胶体金粒径为10-15nm。
[0021] 2. a-葡聚糖-BSA交联物的制备 将日-葡聚糖Dextran T-40与BSA按1:1比例混合，用水溶解调至6% (