一种快速检测重金属铅的免疫胶体金试剂板的制作方法
【技术领域】
[0001]本实用新型涉及胶体金免疫层析领域，更具体地，本实用新型涉及一种快速检测重金属铅的免疫胶体金试剂板。
【背景技术】
[0002]我国总量控制的重金属主要有五种，即汞、铬、镉、铅和类金属砷，兼顾镍、铜、锌、银、钒、锰、钴、铊、锑等重金属污染物。重金属超过人体所能耐受的限度，就会造成人体急性或慢性中毒，其致癌、致畸及致突变作用对人体会造成很大的危害。重金属铅进入人体后最难排泄，其干扰肾功能、生殖功能，导致贫血、神经功能失调、肾损伤等，对儿童危害性大。我国《地表水环境质量标准》(GB 3838-2002) V类地表水水质中铅的限量标准为100 μ g/L,《生活饮用水卫生标准》(GB 5749-2006)中铅的限量标准为10 μ g/L。
[0003]目前，重金属铅的检测方法主要有原子吸收光谱法(AAS)、电感耦合等离子体法、原子荧光光谱法、溶出伏安法、高效液相色谱法(HPLC)、分光光度法、生物化学法等。HPLC、AAS等理化分析方法由于样品前处理过程复杂费时、设备昂贵、检测成本高等原因而无法适合大规模筛选；生物化学法大都具有方便、快速、经济的优点，更适合于重金属污染的现场检测。胶体金免疫层析法应用免疫分析技术、侧向层析技术、胶体金标记技术等，较目前的一些快检手段不仅步骤更为简单，灵敏度、准确性也更高，具有较强的市场竞争能力。近年来该方法在痕量分析方面取得了迅速发展。
【实用新型内容】
[0004]本实用新型针对检测需求，研制开发了一种快速检测重金属铅的免疫胶体金试剂板，通过胶体金免疫法检测水质、水产品等样本中的重金属铅含量。试剂板检测限符合要求，重现性好，检测时间短，无需昂贵的仪器设备，适合现场快速检测。
[0005]为了实现上述目的，本实用新型的技术方案是:一种快速检测重金属铅的免疫胶体金试剂板，包括上下两块塑料模板、PVC底衬、样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述的PVC底衬上从左到右粘有样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述的样品垫叠放于金标抗体结合垫，重叠区域占金标抗体结合垫的1/4-1/3 ;所述的金标抗体结合垫叠放于硝酸纤维素膜左侧，重叠区域占金标抗体结合垫的1/4-1/3 ;所述吸水纸叠放于硝酸纤维素膜的右侧；所述的硝酸纤维素膜上喷有平行的检测线和控制线，两者相距5mm，其中检测线靠近样品垫一端，为人工包被抗原的印记，控制线为羊抗鼠IgG的印记；所述的金标抗体结合垫上喷有胶体金标记的特异性抗体；所述的样品垫和金标抗体结合垫均由玻璃纤维制成。
[0006]本实用新型试剂板的判定法则为:当样品中的重金属铅含量等于或超过试剂板检出限时，试剂板上的检测线显色较控制线浅甚至无显色，判定为阳性；当样品中重金属铅含量在试剂板检出限以下或无残留时，试剂板上的检测线显色与控制线相近或偏深，判定为阴性。
[0007]本实用新型试剂板的各部分组成功能如下:
[0008]PVC底衬，用于固定支撑试剂板其他组成部分。
[0009]样品垫，用于吸收样品溶液和缓冲样品溶液pH值。
[0010]金标抗体结合垫，为样品溶液中有效成分和金标抗体反应提供场所。
[0011]硝酸纤维素膜，通过检测线和控制线上的试剂将溶液中的胶体金颗粒截留于线上，从而可以根据检测线和控制线上颜色深浅来反映检测结果。
[0012]吸水纸，将反应过程中多余的溶液吸收。
[0013]本实用新型试剂板具有如下有益效果:
[0014](I)特异性好。本实用新型试剂板对重金属铅的交叉反应率为100%，对重金属汞、重金属铬、重金属镉、重金属砷的交叉反应率均小于1%。可见，本实用新型试剂板对重金属铅反应具有高度专一性。
[0015](2)灵敏度高。本实用新型试剂板对水中重金属铅的最低检出限为100 μ g/L，符合国家限量要求，达到了国内较优水平。
[0016](3)操作简单、快速、安全。本实用新型试剂板将反应所需的大部分原料整合到塑料底衬中，滴样后，抗原抗体反应在固相膜上快速进行，大大缩短检样时间，且样品无需特殊处理，滴样后3-5分钟即可用肉眼通过判断硝酸纤维素膜上的检测线和控制线的颜色深浅读取结果。检测实施过程不依赖任何实验设备，无需接触有毒试剂，普通人员均可操作。
[0017](4)成本低，易推广。本实用新型试剂板生产工艺简单，流程成熟。生产成本低廉，投资少，收效快。
【附图说明】
[0018]图1为重金属铅免疫胶体金试剂板背衬结构示意图，其中I为样品垫，2为金标抗体结合垫，3为硝酸纤维素膜，4为检测线，5为控制线，6为吸水纸，7为不干胶，8为PVC底衬。
[0019]图2为重金属铅免疫胶体金试剂板操作示意图，其中S为加样孔，C为控制区，T为检测区。
[0020]图3是重金属铅免疫胶体金试剂板结果判定阴性示意图；
[0021]图4是重金属铅免疫胶体金试剂板结果判定阳性示意图；
[0022]图5是重金属铅免疫胶体金试剂板结果判定无效示意图，
[0023]其中C为控制区，T为检测区。
【具体实施方式】
[0024]本实用新型试剂板的制备包括人工抗原的制备，特异性抗体的制备，胶体金溶液的制备，胶体金标记的特异性抗体的制备和重金属铅免疫胶体金试剂板的组装。
[0025]1.人工抗原的制备
[0026]取1.5mg 1-(4 —异硫氰酸苄基)-乙二胺四乙酸(ITCBE)溶于ImL 二甲基亚砜(DMSO)中，取标准硝酸铅溶液(1000mg/L，Pb2+)0.7mL。将ITCBE缓慢滴加入Pb (N03) 2洛液中，用三乙胺将pH调到中性，常温反应过夜。取1mg钥孔血蓝蛋白(KLH)溶于pH 9.0的N—(2—羟乙基)哌嗪一 N’ 2—乙烷磺酸(HEPES)缓冲浴液中，将螯合好的Pb-1TCBE结合物缓慢滴加入蛋白溶液中，反应过程中，保持PH在8.0-9.0之间(不断的用三乙胺调pH,使其值的稳定)。室温反应过夜。反应完全后再10mmol/L的pH为7.4的HEPES缓冲溶液中进行透析，除去未反应的小分子，所得即为人工免疫抗原。放入-20°C保存备用。
[0027]使用牛血清蛋白(BSA)替代KLH，同法制备人工包被抗原。
[0028]2.特异性抗体的制备
[0029]取8周龄BALB/c雄性小鼠用人工免疫抗原进行5次免疫。初次免疫，每只小鼠免疫剂量为150 μ g，与等量福式完全佐剂充分乳化进行背部皮下多点注射；此后每间隔两周免疫一次，每次每只免疫剂量10yg与等量福式不完全佐剂混匀后采用相同方式免疫。进行细胞融合前3d，再加强免疫一次，剂量为150 μ g，腹腔直接注射。
[0030]免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)在质量分数为50%聚乙二醇(PEG)作用下进行细胞融合。融合后的细胞置37 °C，体积分数为5 %的CO2培养箱中以HAT、HT培养基选择培养。用间接酶联免疫吸附(ELISA)法进行阳性筛选。
[0031]体内诱生腹水:给腹腔注射液体石蜡0.5mL，1d后的小鼠腹腔注射克隆化细胞株17个细胞，7d后抽取腹水，采用辛酸-硫酸铵法，对腹水进行纯化。
[0032]3.胶体金溶液的制备
[0033]胶体金颗粒的平均大小为30nm，其制备方法为在10mL去离子水中加入ImL I %柠檬酸三钠，煮沸后迅速加入ImL 1%氯金酸，继续煮沸lOmin，冷却后，4°C下保存备用。
[0034]4.胶体金标记的特异性抗体的制备
[0035]取已制备好的10mL胶体金溶液，用0.lmol/L碳酸钾溶液调pH到8.0。边搅拌边加入1.5mg特异性抗体，搅拌20min，再逐滴加入2mL 25mol/L聚乙二醇20000 (PEG20000)，搅拌15min。20，OOOrpm离心15min，弃上清液，加入1mL pH 7.4PBS缓冲液(含0.4mol/L PEG)清洗2次。将沉淀用5mL含2% BSA的PBS缓冲液(pH 7.4)溶解，用0.22 μ m无菌过滤器过滤后，4°C保存备用。
[0036]5.重金属铅免疫胶体金试剂板的组装
[0037]参照图1，用点膜机把适当浓度的人工包被抗原及羊抗鼠IgG喷在硝酸纤维素膜上，分别作为检测线和控制线，37°C烘箱干燥8h。以同样方法，将制备好的胶体金标记的特异性抗体包被在金标抗体结合垫上。
[0038]检测试剂组成为塑料底衬，在其上按顺序粘上样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸。用切割机将贴好的大卡切割成3.84mm宽的条，装入塑料模板中制成检测试剂板，再放入带干燥剂的铝箔袋中密闭储存。
[0039]6.重金属铅免疫胶体金试剂板检测实施操作方法
[0040]6.1水样处理过程
[0041 ] 取ImL水于5mL离心管中，加入3mL PBST溶液，混匀，待检。
[0042]6.2使用方法
[0043]从包装袋中取出试剂板，吸取待检样品溶液100 μ L滴加到加样孔中，加样后开始计时；结果应在3-5min读取，其他时间判读无效。观察时，试剂板水平放置于观察者正面。
[0044]6.3结果判断
[0045]观察窗中T线显色比C线深或一样深为阴性，表示样品中重金属铅含量低于检出限或不含重金属铅。如图3所示。
[0046]观察窗中T线显色比C线浅或T线无显色为阳性，表示样品中重金属铅含量等于或高于检出限。如图4所示。
[0047]观察窗中未出现C线，可能是操作不当或试剂板已失效。应再次阅读说明书，并用新的试剂板重新测试。如图5所示。
【主权项】
1.一种快速检测重金属铅的免疫胶体金试剂板，其特征在于，包括上下两块塑料模板、PVC底衬、样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述的PVC底衬上从左到右粘有样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述的样品垫叠放于金标抗体结合垫，重叠区域占金标抗体结合垫的1/4-1/3 ;所述的金标抗体结合垫叠放于硝酸纤维素膜左侧，重叠区域占金标抗体结合垫的1/4-1/3 ;所述吸水纸叠放于硝酸纤维素膜的右侧:所述的硝酸纤维素膜上喷有平行的检测线和控制线，两者相距5mm，其中检测线靠近样品垫一端，为人工包被抗原的印记，控制线为羊抗鼠IgG的印记。2.如权利要求1所述的免疫胶体金试剂板，其特征在于，所述的金标抗体结合垫上喷有胶体金标记的特异性抗体。3.如权利要求1所述的免疫胶体金试剂板，其特征在于，所述的样品垫和金标抗体结合垫均由玻璃纤维制成。
【专利摘要】本实用新型涉及一种快速检测重金属铅的免疫胶体金试剂板，由上下两块塑料模板、PVC底衬、样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组成，PVC底衬上依次紧密粘贴着样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸。硝酸纤维素膜从样品垫到吸水纸方向上依次喷有检测线和控制线，可将反应结果以肉眼可见的颜色表征出来。试剂板利用免疫胶体金法可进行重金属铅的半定量直观检测，适合排污企业、环保部门等的现场快速检测。
【IPC分类】G01N33/543, G01N33/558
【公开号】CN204882566
【申请号】CN201520512250
【发明人】王振国, 王森, 陈笑笑, 叶国华, 王伟萍, 胡叶军, 周丽燕
【申请人】绍兴市农产品质量监督检验测试中心, 杭州南开日新生物技术有限公司
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2015年7月2日