专利名称：一种检测庆大霉素残留的免疫胶体金试剂板的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种检测乳制品中抗生素残留试剂板的制备方法，具体涉及一种检测
庆大霉素药物残留的免疫胶体金试剂板的制备方法。
背景技术：
庆大霉素属于氨基糖苷类抗生素，主要作用于革兰氏阴性细菌，由于其抗菌谱广、 疗效佳、价格低廉而广泛应用于兽医临床和动物饲料添加剂。但是庆大霉素在应用过程中 易产生毒副作用，大剂量不规范使用导致动物性食品中的药物残留超标会对人体健康造成 严重危害，产生肾毒性，耳毒性，肌肉阻滞，过敏反应等一系列毒副作用。我国农业部第235 号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》中规定庆大霉素在乳制品中的残留限量标准为 100ng/mL。 目前，对于庆大霉素药物残留的检测方法主要有理化分析法和免疫分析法。理化 分析法常用的有高效液相色谱法(HPLC)和液相色谱/质谱联用分析法(LC-MS)，特异性好、 准确率高，是各大检测机构对检测样本进行确证的首选方法。但理化分析法存在对设备、环 境、操作技能等要求，不利于大规模样本筛选，因而不适用于广大基层部门。免疫分析法常 用的有酶联免疫吸附法(ELISA)和免疫层析法(GICA)， ELISA法检测量大，操作相对简单， 越来越多地被用于动物性食品中抗生素残留的检测，但是整个操作时间仍需要l-2h，且需 用到特殊仪器设备，具有一定局限性。GICA法灵敏、快速、特异、简便，近年来倍受国内外学 者关注，是今后庆大霉素残留快速检测的发展方向。
发明内容
本发明的目的在于提供一种灵敏度高，特异性好，简便快速，生产成本低的庆大霉 素免疫胶体金试剂板的制备方法。 本发明试剂板由上下两块塑料模板、背衬及粘附在背衬上依次紧密相连的样品 垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫组成。 其中样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫相邻各部分间有l-2mm的重 叠，其目的一方面是保证层析作用从样品垫到吸水垫部位顺利进行，另一方面是为了使样 品溶液与样品垫有充分反应时间，样品垫上的缓冲体系可以中和样品溶液的酸碱度，保证 样品溶液中的有效成分与胶体金结合垫上的金标抗体顺利发生反应。 胶体金结合垫上包被有抗庆大霉素单克隆抗体与胶体金的结合物；硝酸纤维素膜 上从样品垫到吸水垫方向依次包被有庆大霉素_载体蛋白偶联物和羊抗鼠IgG，分别作为 检测线和质控线。偶联庆大霉素的载体蛋白可为牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(0VA)、血 蓝蛋白(KLH)等。抗庆大霉素克隆抗体为可以识别庆大霉素的免疫球蛋白或其片段。
本发明试剂板的各部分组成成分与功能如下 塑料模板，起固定试纸条及标示功能区(加样孔、检测区、控制区)的作用 背衬为一面涂有不干胶的不吸水的韧性材料，如PVC板，起固定支持试纸其他组成部分的作用。 样品垫由玻璃纤维制成，起吸收样品溶液与缓冲样品溶液pH值的作用。 胶体金结合垫由聚酯膜制成，其上标记有抗庆大霉素单克隆抗体与胶体金的结合
物，是样品溶液中的有效成分与金标抗体发生反应的场所。 硝酸纤维素膜部分主要作用是将反应结果以肉眼可见的颜色表征出来。
吸水垫为滤纸，作为吸水部分其作用是将移动上来的多余的溶液吸收。
本发明试剂板具有如下有益效果 (1)特异性好。本发明试剂板对庆大霉素的交叉反应率为100%，对其他种类的抗 生素包括链霉素、双氢链霉素、新霉素的交叉反应率均低于1 % ，可见，本发明试剂板对庆大
霉素有高度专一性。 (2)灵敏度高。本发明试剂板对原奶中庆大霉素的检出限为50ppb(ng/mL)，可以 满足我国农业部第235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》中对庆大霉素在乳制品 中最高残留限量100ng/mL的规定要求。 (3)操作简单快捷，不依赖任何实验设备，不需任何专业培训。本发明试剂板将反 应所需的大部分原料整合到试剂条中，滴样后抗原抗体反应在固相膜上快速进行，大大縮 短了检样时间，且样品无需特殊处理，滴样后5-10分钟内即可用肉眼通过判断硝酸纤维素 膜上的检测线和质控线的颜色深浅读取结果，检测过程无需特殊仪器辅助，普通人员均可 操作，不需要专业培训，极易推广使用。 (4)成本低，效益好。本发明试剂板生产工艺成熟、流程简单，生产成本低廉，投资 少，收效快。
图1为庆大霉素免疫胶体金快速检测试剂板结构示意图，其中1为样品垫，2为胶 体金结合垫，3为硝酸纤维素膜，4为检测线，5为质控线，6为吸水垫，7为不干胶，8为PVC板。 图2为庆大霉素免疫胶体金快速检测试剂板操作示意图，其中S为加样孔，C为控 制区，T为检测区。 图3为庆大霉素免疫胶体金快速检测试剂板结果判定示意图，其中C为控制区，T 为检测区。 具体实施方法 本发明试剂板的制备包括庆大霉素-BSA偶联物的制备，抗庆大霉素单克隆抗体
的制备，胶体金溶液的制备，胶体金标记抗庆大霉素单克隆抗体的制备和庆大霉素免疫胶
体金快速检测试剂板的组装。 1.庆大霉素与载体蛋白的偶联 采用碳二亚胺(EDC HC1)法将庆大霉素与载体蛋白偶联制备免疫抗原及包被抗 原。称取20mgBSA，加入lmL蒸馏水。另外用lmL蒸馏水溶解20mg EDC HC1和20mg庆大 霉素，加入到上述溶液中。将溶液混匀后，置于4t:下避光反应12小时(期间可颠倒混匀)。 用PBS缓冲液透析4天，期间每间隔8小时换液1次。之后将溶液离心，收集上清液，-20°C 下冻存备用。
2.抗庆大霉素单克隆抗体的制备 取6 8周龄雌性Balb/c小鼠，将作为免疫原的庆大霉素_BSA偶联物与等体积 的弗氏完全佐剂乳化，按100 g/只剂量皮下注射，之后每隔3周加强免疫1次，用不完全 佐剂腹腔注射。融合前3d强化免疫l次，不用佐剂，剂量加倍。细胞融合按常规方法进行 将Sp2/0多发性骨髓瘤细胞与免疫脾细胞按1 : 10的比例混合，在50XPEG作用下融合， HAT培养基悬浮，分种于96孔培养板中，371\5% C02培养箱中培养。 融合后，待细胞生长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞。初 筛选择10mg/L庆大霉素载体蛋白(OVA)偶联物包被酶联板，被测孔加培养上清，孵育、清洗 后，加入羊抗鼠IgG-HRP(l : 1000) ， OPD显色。筛选出的阳性孔再用庆大霉素-OVA包被的 酶联板进行阻断间接ELISA。将细胞培养上清与2X10—^Ql/L庆大霉素溶液等量混合，37t: 感作lh，加入已包被的酶标板中。另外用PBS(O. 01mol/L、 pH7. 4)替代庆大霉素溶液作对 照，其余步骤同上。若庆大霉素阻断后的0D值降至对照孔的50X以下，则判为阳性孔。经 2 3次检测都呈阳性的孔，立即用有限稀释法进行克隆化。 体外培养将克隆化的细胞株扩大培养，细胞浓度达5X 105/mL时停止换液，细胞 全部死亡后收集培养液。体内诱生腹水给腹腔注射液体石蜡10天后的小鼠腹腔注射克隆 化细胞株107个细胞，7天后抽取腹水。
3.胶体金溶液的制备 胶体金颗粒的平均大小为30nm，其制备方法为在lOOmL去离子水中加入lmL 1% 柠檬酸三钠，煮沸后迅速加入lmL 1%氯金酸，继续煮沸10min，冷却后，4t:下保存备用。
4.胶体金标记抗庆大霉素单克隆抗体的制备 取已制备好的胶体金溶液lOOmL，用O. lmol/L碳酸钾溶液调pH到8.0。边搅 拌边加入2mg抗庆大霉素单抗，搅拌20min，逐滴加入2mL 25mol/L聚乙二醇20000 (PEG 20000)，搅拌15min。 20， OOOrpm离心15min，弃上清液，加入10mL pH 7. 4的PBS缓冲液 (含0. 4mol/L PEG)清洗2次。将沉淀用10mL含2% BSA的PBS缓冲液(pH 7. 4)溶解，用 0. 22 ii m无菌过滤器过滤后，4t:保存备用。
5.庆大霉素免疫胶体金快速检测试剂板的组装 参照图l，用点膜机把适当浓度的庆大霉素-载体蛋白偶联物及羊抗鼠IgG喷在硝 酸纤维素膜上，分别作为检测线和质控线，37t:烘箱干燥8h。以同样方法，将制备好的金标 记庆大霉素单克隆抗体包被在胶体金结合垫上。 检测试剂组成为一个PVC背衬，在其上按顺序粘上样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤 维素膜和吸水垫。用切割机将贴好的大卡切割成4mm宽的条，装入塑料模板中制成检测试 剂板，再放入带干燥剂的铝箔袋中密闭储存。
6.庆大霉素免疫胶体金快速检测试剂板检测原理 当待检样品溶液滴入试剂板加样孔后，样品溶液因硝酸纤维素膜载体的毛细管作 用向另一端扩散。在移动的过程中，会发生相应的抗原抗体反应，并通过免疫胶体金的颜色 显示出来。如果样品溶液含有庆大霉素残留，庆大霉素先和胶体金颗粒上的抗体反应，因此 当胶体金颗粒随样品溶液扩散至检测线时，胶体金颗粒上抗体的活性位点因被样品溶液中 的庆大霉素占据而无法与检测线上庆大霉素特异性抗原结合；当样品中的庆大霉素含量超 过试剂板检出限时，试剂板上的检测线显色较控制线浅甚至无显色，判定为阳性。反之，当样品中庆大霉素含量在试剂板检出限以下或无残留时，试剂板上的检测线显色与控制线相 近或偏深，判定为阴性。 7.庆大霉素免疫胶体金快速检测试剂板检测实施例操作方法
7. l样品制备 取400ii L庆大霉素专用PBST缓冲液加入洁净的1. 5mL离心管中，用滴管吸取3 滴(约lOOyL)原奶加入离心管中，混合均匀，吸取混合溶液待检。
7. 2检测步骤 从包装袋中取出试剂板，用滴管吸取待检溶液，在加样孔中滴入3滴(约100 L)， 加样后开始计时，结果应在3 5分钟读取，其他时间判读无效。
7. 3结果判断 读取结果时，将试剂板水平置于观察者正面，如图2右侧所示。 阴性(-):T线显色比C线深或一样深，表明样品中庆大霉素药物浓度低于50ng/
mL或无庆大霉素药物残留。如图3.a所示。 阳性(+) :T线显色比C线浅，或T线无显色，表明样品中庆大霉素药物浓度高于 50ng/mL ;T线比C线越浅，表明样品中庆大霉素药物浓度越高。如图3. b所示。
无效未出现C线，可能操作不当或试剂板已失效。应再次阅读说明书，并用新试 剂板重新测试。如图3.c所示。
权利要求
一种庆大霉素免疫胶体金试剂板的制备方法，其特征在于醋酸纤维膜上的胶体金结合垫上包被有抗庆大霉素单克隆抗体-胶体金标记物，从样品垫到吸水垫方向依次是检测线和质控线，包被有庆大霉素-载体蛋白偶联物和羊抗鼠IgG。
2. 如权利要求1所说的标记物，其特征在于将胶体金与抗庆大霉素单克隆抗体按一定 比例混匀，使胶体金与抗庆大霉素单克隆抗体形成稳定的胶体金颗粒，通过浓縮形成抗庆 大霉素单克隆抗体_胶体金标记物。
3. 如权利要求书l所说的检测线，其特征在于偶联庆大霉素的载体蛋白可为牛血清白 蛋白(BSA)、卵清蛋白(0VA)、血蓝蛋白(KLH)等。
4. 如权利要求1所说的制备方法，其特征在于样品中的庆大霉素含量超过试剂板检出 限时，试剂板上的检测线显色较控制线浅甚至无显色，判定为阳性；反之，当样品中庆大霉 素含量在试剂板检出限以下或无残留时，试剂板上的检测线显色与控制线相近或偏深，判 定为阴性。
5. 如权利要求1所说的制备方法，其特征在于工艺流程包括制备庆大霉素-BSA偶联 物、制备抗庆大霉素单克隆抗体、制备胶体金溶液、制备胶体金标记抗庆大霉素单克隆抗体 和组装庆大霉素免疫胶体金快速检测试剂板。
全文摘要
本发明涉及一种检测乳制品中庆大霉素药物残留的免疫胶体金试剂板的制备方法。该试剂板由上下两块塑料模板和试纸条组成。在试纸条背衬上依次紧密粘贴有样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，相邻各部分间有1-2mm的重叠。胶体金结合垫上包被有抗庆大霉素单克隆抗体与胶体金的结合物，硝酸纤维素膜上从样品垫到吸水垫方向依次包被有庆大霉素-载体蛋白偶联物和羊抗鼠IgG，分别作为检测线和质控线。该试剂可半定量直观检测样品中的庆大霉素残留，整个检测过程需5～10分钟，无需任何实验设备，利于大规模样本筛选，适合于广大基层部门对乳制品中的庆大霉素进行大规模快速检测。
文档编号G01N33/577GK101726598SQ200910154330
公开日2010年6月9日 申请日期2009年11月27日 优先权日2009年11月27日
发明者卜令杰, 张少恩, 桑丽雅, 邵伟 申请人:杭州南开日新生物技术有限公司