D-二聚体胶体金法检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物检测领域，特别是涉及一种D-二聚体胶体金法检测试剂盒及其 制备方法和用途。
【背景技术】
[0002] D-二聚体是交联纤维特异性降解产物，也是继发性纤溶特有代谢产物。D-二聚 体是在各种病理或生理状态下，凝血系统激活导致凝血活酶将纤维蛋白原转化成纤维蛋白 体，并在活化因子XIII的作用下形成交联纤维蛋白。D-二聚体是交联纤维蛋白在纤溶酶讲 解过程中所释放碎片进一步降级产生的含有γ链的片段。受到病理因素影响，机体凝血及 纤溶动态平衡遭到破坏，凝血倾向不断增加，从而导致纤维蛋白降解产物增加。因此，D-二 聚体含量升高，表明机体内存在纤维蛋白血栓形成和纤溶发生，临床上也将D-二聚体含量 的变化作为机体高凝状态与纤溶亢进状态的分子标志物。
[0003] D-二聚体的检测是临床对继发性纤溶灵敏度较高、特异性强的检验项目，是目前 判断机体高凝状态和鉴别原发性与继发性纤溶、观察溶栓治疗效果等方面有重要临床价值 的指标。D-二聚体的检测有重大的临床应用价值：可用于弥漫性血管内凝血（DIC)的早期 诊断，深静脉血栓（DVT)及肺栓塞的筛查，急性脑梗死的早期诊断、治疗和愈后观察，肝病 的治疗和诊断及对恶性肿瘤的疗效和愈后观察等。
[0004] 因此，对D-二聚体的快速、全面、准确、特异检测显得尤为重要。
【发明内容】
[0005] 鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种D-二聚体胶体金法 检测试剂盒及其制备方法和用途，用于解决现有技术中的问题。
[0006] 为实现上述目的及其他相关目的，本发明采用以下技术方案：
[0007] 本发明的第一方面，提供一种D-二聚体胶体金法检测试剂盒，包括试纸卡，所述 试纸卡包括底板、及位于底板表面的从加样端开始依次排列的样品垫、金标垫、硝酸纤维素 膜和吸水垫，所述金标垫上包含胶体金标记的抗D-二聚体单克隆抗体-1，所述硝酸纤维素 膜上包被有检测线和质控线。
[0008] 优选的，所述底板为PVC底板。
[0009] 优选的，所述硝酸纤维素膜上，检测线位于离加样端较近一侧，质控线位于离加样 端较远一侧。
[0010] 优选的，所述检测线上包被有抗D-二聚体单克隆抗体-2。
[0011] 优选的，所述质控线上包被有羊抗鼠免疫球蛋白IgG。
[0012] 所述抗D-二聚体单克隆抗体-1和抗D-二聚体单克隆抗体-2可以是相同的单克 隆抗体，也可以是不同的单克隆抗体。
[0013] 优选的，所述抗D-二聚体单克隆抗体-1为Abeam:? Anti-D-Dimer抗体[DD1]， 所述抗D-二聚体单克隆抗体-2为Abcam：](. Anti-D-Dimer抗体[DD1]，或所述抗D-二聚体 单克隆抗体_1为Abeam? Anti-D-Dimer抗体[DD1]，所述抗D-二聚体单克隆抗体-2为 AbcarrKljC Anti-D-Dimer 抗体[DD2]。
[0014] 优选的，所述样品垫采用缓冲液处理，所述缓冲液选自PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲 液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液和柠檬酸-磷酸盐缓冲液中的一种或多种的组合，缓冲液 的浓度为50-100mM。
[0015] 优选的，本发明所述的金标垫还经过预处理，预处理时所使用的预处理缓冲液选 自甘氨酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、硼酸盐缓冲液的一种或多种的组合，缓冲液的浓度为 10-40mM〇
[0016] 更优选的，为了使得试剂盒具有更佳的灵敏度和显色效果，所述缓冲液还包括 NaCl和冠醚，所述冠醚选自二环已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠醚-6中的一种或多种 的组合，NaCl在缓冲液中的浓度为0. l-20mg/ml，冠醚在缓冲液中的浓度为0. l-20mg/ml。
[0017] 更优选的，NaCl在缓冲液中的浓度为0. 25-0. 5mg/ml，冠醚在缓冲液中的浓度为 4_8mg/ml〇
[0018] 所述预处理缓冲液的溶剂为水。
[0019] 所述预处理的具体步骤为：将金标垫在预处理液中浸泡1. 5~2h，取出放于36~ 38°C烘干。
[0020] 所述预处理缓冲液可使用本领域各种常用的pH调节剂进行pH值的调节。
[0021] 优选的，所述试剂盒还包括卡壳，所述卡壳包括背卡和上盖，所述背卡设有试纸卡 卡槽，所述试纸卡嵌于所述试纸卡卡槽内，所述上盖设有测试窗和加样孔，所述测试窗的位 置与所述检测线和质控线的位置相配合，所述加样孔的位置与所述样品垫的位置相配合。
[0022] 更优选的，所述卡壳为塑料卡壳。
[0023] 优选的，所述检测试剂盒用于检测样品中的D-二聚体，所述样品选自人全血、血 清或血浆中的一种或多种的组合。
[0024] 本发明第二方面提供所述D-二聚体胶体金法检测试剂盒的制备方法，包括如下 步骤：
[0025] 1)用胶体金标记的抗D-二聚体单克隆抗体-1溶液喷涂金标垫，制得包含抗D-二 聚体单克隆抗体-1的金标垫；
[0026] 2)在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上分别喷涂抗D-二聚体单克隆抗体-2及羊 抗鼠免疫球蛋白IgG，制得包被后的硝酸纤维素膜；
[0027] 3)将样品垫、步骤1)制备金标垫、步骤2)制备的硝酸纤维素膜、吸水垫依次粘贴 在底板上，切裁制得检测试纸卡；最后将检测试纸卡装入卡壳制得检测试剂盒。
[0028] 优选的，本发明所述的金标垫还经过预处理，预处理时所使用的预处理缓冲液选 自甘氨酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、硼酸盐缓冲液的一种或多种的组合，缓冲液的浓度为 10-40mM〇
[0029] 更优选的，为了使得试剂盒具有更佳的灵敏度和显色效果，所述缓冲液还包括 NaCl和冠醚，所述冠醚选自二环已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠醚-6中的一种或多种 的组合，NaCl在缓冲液中的浓度为0. l-20mg/ml，冠醚在缓冲液中的浓度为0. l-20mg/ml。
[0030] 更优选的，NaCl在缓冲液中的浓度为0. 25-0. 5mg/ml，冠醚在缓冲液中的浓度为 4_8mg/ml〇
[0031] 所述预处理缓冲液的溶剂为水。
[0032] 所述预处理的具体步骤为：将金标垫在预处理液中浸泡1. 5~2h，取出放于36~ 38°C烘干。
[0033] 所述预处理缓冲液可使用本领域各种常用的pH调节剂进行pH值的调节。
[0034] 本发明第三方面提供所述D-二聚体胶体金法检测试剂盒在D-二聚体检测领域的 用途。
[0035] 本发明的有益效果为：
[0036] 本发明所提供的D-二聚体胶体金法检测试剂盒兼具高灵敏性和高特异性，能够 快速检测D-二聚体。此外，所述检测试剂盒具有操作快速简便、结果准确、经济适用等优 点。
【具体实施方式】
[0037] 以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书 所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实 施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离 本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0038] 在进一步描述本发明【具体实施方式】之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下 述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体 实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中 另外明确指出，单数形式"一个"、"一"和"这个"包括复数形式。
[0039] 当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端 点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和 科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、 材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本 发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实 现本发明。
[0040] 除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术 领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技 术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook 等 MOLECULAR CLONING :A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001;Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John ffiley&Sons,New York,1987and periodic updates ；the series METHODS IN ENZYM0L0GY,Academic Press,San Diego ；ffolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego, 1998 !METHODS IN ENZYM0L0GY， Vol. 304,Chromatin