一种一步均相d-二聚体检测试剂盒及其应用
【专利摘要】本发明提供了一种一步均相D?二聚体检测试剂盒及其在检测D?二聚体含量中的应用，所述试剂盒包括：(1)抗D?二聚体抗体偶联的发光微球试液；(2)抗D?二聚体抗体偶联的感光微球试液；以及能够接收和发射光的反应孔。与现有技术相比，本发明试剂盒具有操作方便、检测快速、灵敏度高、准确性好等优点，并且特异性强。将其应用于高凝状态和血栓性疾病的监测，可以提高高凝状态和血栓性疾病的准确率。
【专利说明】
一种一步均相D-二聚体检测试剂盒及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于检测试剂盒领域，特别涉及一种一步均相D-二聚体检测试剂盒及其应 用。
【背景技术】
[0002] 纤维蛋白溶解系统是人体最重要的抗凝系统。在纤溶过程中，凝血酶在水解纤维 蛋白原后，即相继释放出纤维蛋白肽(A和B)，剩余的可溶性纤维蛋白单体，在因子Ma作用 下，形成稳定的交联纤维蛋白，交联纤维蛋白在纤溶酶的降解过程中，释放的碎片进一步降 解为最小片段D-二聚体。在病理状态下，凝血与纤溶的动态平衡遭到破坏，凝血倾向增强， 从而纤维蛋白降解产物增加，导致D-二聚体含量增加。D-二聚体水平的增高，表明体内有纤 维蛋白血栓形成和纤溶发生，所以临床上可作为体内高凝状态和纤溶亢进的分子指标。
[0003] D-二聚体来源于纤溶酶溶解的交联纤维蛋白凝块。凝血系统激活使凝血酶作用于 纤维蛋白原，将其转变成纤维蛋白单体(α、β、γ )2即D-E-D结构，并有规则连接为可溶性纤 维蛋白单体聚合体(SFMC)。后者进一步在Ca2+与Xma作用下，单体间发生α链与γ链交联 (D-D交联)形成稳定的不溶性纤维蛋白聚合体。交联纤维蛋白的生成又激活纤溶酶溶解系 统。纤维蛋白溶解系统由纤溶酶原、纤溶酶原激活剂、纤溶酶溶解酶、纤溶酶溶解酶抑制物4 个主要部分组成。当纤维蛋白凝结块形成时，在组织型纤溶酶溶解酶原激活物存在的条件 下，纤溶酶溶解酶原激活转化为纤溶酶溶解酶，纤维蛋白溶解过程开始，纤溶酶溶解酶降解 纤维蛋白凝结块形成各种可溶片段(X'、Y'、D、E等碎片）』-二聚体是通过γ链相连的2个D 碎片连接起来的片段(00、0乂0、00/^、￥乂0等复合物），是交联纤维蛋白的特异性降解产物。
[0004] D-二聚体在临床检验中应用的十分广泛。有研究表明，心血管疾病由于血管壁的 损伤、血小板的激活、凝血机制的亢进及血液状态的变化，使循环血液中的有形成分在心脏 或血管内形成异常凝块，堵塞部分或全部血管腔导致急性心肌梗死或脑梗死，引起D-二聚 体含量升高。脑梗死D-二聚体检测结果及阳性率最高。有资料显示其含量与梗死面灶的体 积及病情轻重呈明显正相关。动态测定血浆D-二聚体含量可作为急性脑梗死病程判断及疗 效观察的有用指标。对妊娠高血压综合征患者血浆D-二聚体的测定结果表明，妊娠高血压 综合征患者血浆D-二聚体高于正常晚孕妇女，而且随病情的发展而明显升高，故认为D-二 聚体升高是妊娠高血压综合征导致弥散性血管内凝血(DIC)时最早出现的阳性指标。大量 临床资料证明，恶性肿瘤存在纤溶活性亢进，这与恶性肿瘤细胞具有高水平的纤维蛋白溶 解酶激酶有关，并可分泌大量纤维蛋白原激活物，其主要类型是尿激酶型，能导致局部纤维 蛋白溶解，使D-二聚体水平升高。D-二聚体含量与恶性肿瘤病情进展有相关性。D-二聚体作 为交联纤维蛋白的特异降解产物，其水平的增高反映着继发性纤溶的增强，在临床上已被 视为体内高凝状态和纤溶亢进的分子标志物之一。动态观察患者体内的D-二聚体水平变 化，对高凝状态和血栓性疾病的诊断及预后判断有一定实用价值。
[0005] 目前用于检测D-二聚体的方法主要有放射性免疫分析法(RIA)、酶联免疫吸附试 验(ELISA)，胶体金免疫层析法(GICA)和化学发光免疫分析法(CLIA) ΑΙΑ有很高的检测灵 敏度，但由于标记物具有放射性危害，标记物稳定性差，废弃物难以处理等缺点，已逐渐退 出临床检验领域;ELISA法采用辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)或碱性磷 酸酶标记抗体，并催化底物产生颜色变化，具有操作简单，试剂稳定期长的特点，但ELISA法 的检测灵敏度较低，目前主要应用于传染性疾病筛查等对检测灵敏度要求较低的项目； GICA具有操作简单，检测速度快等优点，但也存在灵敏度低，试剂不稳定，重复性较差，难以 进行定量的缺点。CLIA具有操作简单，检测速度快、高通量检测等优点，但也存在非均相反 应、检测时间长、实际稳定性差、批内批间变异大的缺点。
【发明内容】
[0006] 发明目的：为解决上述问题，本发明利用D-二聚体的抗体，以氧通道化学发光技术 为平台，研发出一种针对高凝状态和血栓性疾病诊断的D-二聚体快速检测试剂。使其与现 有检测试剂相比，具有操作方便、检测快速、灵敏度高、准确性好等优点;将其应用于高凝状 态和血栓性疾病的监测，可以提高高凝状态和血栓性疾病的准确率。
[0007] 技术方案:本发明提供了一种一步均相D-二聚体检测试剂盒，包括：
[0008] (1)抗D-二聚体抗体偶联的发光微球试液；
[0009] (2)抗D-二聚体抗体偶联的感光微球试液；
[0010] (3)分析缓冲液；
[0011]以及能够接收和发射光的反应孔。
[0012] 作为优选，所述抗D-二聚体抗体为针对D-二聚体不同表位的单克隆抗体或多克隆 抗体，其可通过常规免疫学方法获得。
[0013] 所述发光微球表面活性基团为醛基、羧基、氨基等，发光微球带有发光化合物和镧 系元素化合物的高分子。发光化合物可以是Dioxene(二氧杂环己稀)或Thioxene(二甲基噻 吩）的衍生物等，镧系元素化合物可以是Eu(TTA)3/T0P0或Eu(TTA)3/Phen等，发光微球大小 为100-300nm，该微球可由市场购得，如铂金埃尔默公司。
[0014] 所述感光微球表面活性基团为醛基、羧基、氨基等，感光微球带有光激发产生单线 态氧的染料，如酞箐染料、叶绿素等，感光微球大小为100_300nm，该微球可由市场购得，如 铂金埃尔默公司。
[0015]所述抗D-二聚体抗体偶联的发光微球，其中发光微球与抗D-二聚体抗体的质量比 为(1-100): 1;所述抗D-二聚体抗体偶联的发光微球试液的浓度为10-200μg/ml。
[0016]所述抗D-二聚体抗体偶联的感光微球，其中感光微球与抗D-二聚体抗体的质量比 为(1-100): 1;所述抗D-二聚体抗体偶联的感光微球试液的浓度为10-200μg/ml。
[0017]所述反应孔为微孔板、微流控试剂盘、反应杯或反应管等。
[0018] 所述分析缓冲液的制备，包括如下步骤：将HETOS 0.1-2g、BSA0.1-5g、Casein 0.1-5g、NaCl 0.5-3g、Triton X-100 0.01-lml加入蒸馏水溶解后，制成分析缓冲液。
[0019]所述抗D-二聚体抗体偶联的发光微球试液或抗D-二聚体抗体偶联的感光微球试 液主要由以下步骤制成：
[0020] ⑴将抗体加入到超滤管中，离心，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复洗涤，抗体稀释到 lmg/ml备用；取发光微球或者感光微球，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复清洗两次，离心，去除 上清；
[0021 ] (2)将抗体溶液加入到发光微球或感光微球中，重悬；
[0022] (3)加入 10%Tween20;
[0023] (4)加入400mM NaCNBH3,加入HEPES缓冲液将体积补足；
[0024] (5)37 Γ震荡反应24-48小时；
[0025] (6)封闭：用800mMNa0H配制65mg/ml CM0溶液，加到反应体系中；
[0026] (7)37°C 震荡反应；
[0027] (8)离心，去除上清；
[0028] (9)加入Tris-HCl(pH8.0)缓冲液重悬，离心，去除上清，重复一次；
[0029] (10)最后一次离心后用roS缓冲液(pH7-8)和牛血清白蛋白混合液重悬微球，终浓 度5mg/ml，使用前稀释至所需浓度。
[0030] 本发明还提供了所述一步均相D-二聚体检测试剂盒在检测D-二聚体含量中的应 用。
[0031] 其中，检测方法包括以下步骤：
[0032] (1)在试剂盒的反应孔中加入样品、抗D-二聚体抗体偶联的发光微球试液和抗D-二聚体抗体偶联的感光微球试液，混合反应5-60分钟；
[0033] (2)激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得光信号值；
[0034] (3)绘制D-二聚体浓度与光信号值的标准曲线，利用步骤(2)测得的光信号值，通 过标准曲线计算D-二聚体含量。
[0035] 技术效果:与现有技术相比，本发明试剂盒具有操作方便、检测快速、灵敏度高、准 确性好等优点，并且特异性强。将其应用于高凝状态和血栓性疾病的监测，可以提高高凝状 态和血栓性疾病的准确率。
【附图说明】
[0036]图1是本发明D-二聚体氧通道化学发光检测试剂盒原理示意图；
[0037] 图2是本发明D-二聚体氧通道化学发光检测试剂盒检测线性范围图；
[0038] 图3是本发明试剂盒与罗氏D-二聚体试剂盒的检测结果相关性比较。
【具体实施方式】
[0039]根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限 制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0040]实施例1试剂盒
[0041 ]实验中原料来源及试剂配方：
[0042]
[0043]
[0044] -、抗D_二聚体抗体偶联发光微球，以醛基发光微球为例：
[0045] 1)将0 . lmg抗体加入到超滤管中，离心10分钟，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复洗涤6 次后，抗体稀释到lmg/ml备用。取lmg发光微球，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复清洗两次，离 心，去除上清。
[0046] 2)将抗体溶液加入到发光微球(购自铂金埃尔默公司）中，重悬。
[0047] 3)加入 1·25μ1 10%Tween20〇
[0048] 4)加入10μ1 400mMNaCNBH3,加入HEPES缓冲液将体积补足到200μ1。
[0049] 5)37°C震荡反应24-48小时。
[0050] 6)封闭：用800mMNa0H配制65mg/ml CM0溶液。加10μ1 CM0溶液到反应体系中。
[0051] 7) 37 Γ震荡反应1小时。
[0052] 8)离心，去除上清。
[0053] 9)加入200ylTris-HCl(pH8.0)缓冲液重悬，离心，去除上清。重复一次。
[0054] 10)最后一次离心后用200μ1 PBS缓冲液(pH7-8)和牛血清白蛋白混合液重悬微 球，终浓度0.5mg/ml，使用前稀释至所需浓度。
[0055]二、抗D-二聚体抗体偶联感光微球，以醛基感光微球为例：
[0056] 1)将0 . lmg抗体加入到超滤管中，离心10分钟，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复洗涤6 次后，抗体稀释到lmg/ml备用。取lmg感光微球，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复清洗两次，离 心，去除上清。
[0057] 2)将抗体溶液加入到感光微球(购自铂金埃尔默公司）中，重悬。
[0058] 3)加入 2·5μ1 10%Tween20〇
[0059] 4)加入10μ1 400mM NaCNBH3,加入HEPES缓冲液将体积补足到200μ1。
[0060] 5 )37 °C震荡反应24-48小时。
[0061 ] 6)封闭：用800mMNa0H配制65mg/ml CM0溶液。加10μ1 CM0溶液到反应体系中。
[0062] 7)37Γ震荡反应1小时。
[0063] 8)离心，去除上清。
[0064] 9)加入200ylTris-HCl(pH8.0)缓冲液重悬，离心，去除上清。重复一次。
[0065] 10)最后一次离心后用200μ1 PBS缓冲液(pH7-8)和牛血清白蛋白混合液重悬微 球，终浓度0.5mg/ml，使用前稀释至所需浓度。
[0066]三、试剂盒的制备：
[0067]按所述用量量取各个组分：
[0068]
[0069] 加入90ml蒸馏水溶解后调节pH到7.4,水补足到100ml，制成分析缓冲液。
[0070] 1)使用分析缓冲液稀释偶联D-二聚体抗体的发光微球浓度为10-200μg/ml;
[0071 ] 2)使用分析缓冲液稀释偶联D-二聚体抗体的感光微球浓度为10-200μg/ml。
[0072]实施例2试剂盒的应用 [0073]试剂盒使用方法，包括如下步骤：
[0074] 1)在试剂盒的反应孔中加入样品、抗D-二聚体抗体偶联的发光微球和抗D-二聚体 抗体偶联的感光微球，混合反应5-60分钟；
[0075] 2)激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得光信号值。
[0076]此试剂盒的反应孔可以是微孔板、微流控试剂盘、反应杯、反应管等。
[0077]本发明试剂盒方法学评价：
[0078] 1.线性
[0079] 配制浓度为Ong/ml，100ng/ml，500ng/ml，2500ng/ml，10000ng/ml，50000ng/ml， lOOOOOng/ml的D-二聚体标准品溶液。在反应孔中分别加入5μ1标准品、加入20μ1偶联抗D-二聚体抗体的发光微球(终浓度l〇μg/ml)，加入20μ1偶联抗D-二聚体抗体的感光微球(终浓 度lOμg/ml)，室温暗处温育15分钟。温育后，激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获 得光信号值。
[0080] 如上用本发明所制备的D-二聚体含量检测试剂盒对其进行检测，绘制各检测试剂 盒标准工作曲线(见附图2)。从附图2可以看出本发明所制备的检测试剂盒能保持良好的线 性，D-二聚体浓度为100000ng/mL时方法无 Hook效应。
[0081 ] 2.准确度
[0082] 准确性测量是指用已知量D-二聚体标准品加入到正常人的血清标本中，测量加入 后浓度值与加入的理论值进行比较，计算D-二聚体的回收率。检测结果如下：
[0083]
[0084] 3.精密度
[0085] 选取3份不同浓度的标本，分别按照本发明所述的方法重复测量20次。根据20次的 测量结果，计算平均偏差C.V. %值。
[0086]
[0087] 4.分析灵敏度
[0088] 分析灵敏度的定义为:是指在统计学意义上能与零剂量区别的量。重复20次测量 零剂量点，计算其平均值(X)和标准差(SD)，以X+2SD的计算的浓度值即为该试剂盒的分析 灵敏度。本发明试剂盒的分析灵敏度为1 〇ng/m 1。
[0089] 5.特异性
[0090] 检测本发明的氧通道化学发光免疫分析试剂在干扰性物质(溶血、高血脂、高胆红 素)存在的情况下检测标本的准确性。将血红蛋白溶液(5mg/ml)分别取适量加入到lml的D-二聚体阳性血清标本中，使血清中血红蛋白的含量分别为lmg/ml、0.5mg/ml。将甘油三酯溶 液(5mg/ml)分别取适量加入到lml的D-二聚体阳性血清标本中，使血清中甘油三酯的含量 分别为lmg/mL、0.5mg/ml。将胆红素溶液(5mg/ml)分别取适量加入到lml的D-二聚体阳性血 清标本中，使血清中胆红素的含量分别为50ng/ml、25ng/ml。对加入了血红蛋白、甘油三酯 和胆红素的D-二聚体阳性标本进行测定，在反应孔中每孔分别加入5μ1含加入了血红蛋白、 甘油三酯和胆红素的D-二聚体阳性标本，加入20μ1偶联抗D-二聚体抗体的发光微球(终浓 度l〇μg/ml)，加入20μ1偶联抗D-二聚体抗体的感光微球(终浓度10μg/ml)，室温暗处温育15 分钟。温育后，激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得光信号值。将理论浓度与实 测浓度的比值作为回收率，回收率在97.05%-105.23%之间。表明D-二聚体氧通道化学发 光试剂在检测血清样本时不受血红蛋白、甘油三酯、胆红素的干扰。
[0091]
[0092] 6.相关性
[0093] 如图3所示，与Roche(罗氏）D-二聚体化学发光试剂盒的相关性为：y = 0.9994x+ 151.5，R2 = 0.9986
[0094] 本发明与现有方法和产品相比，具有检测灵敏度高、特异性好、成本较低，对检测 仪器要求低的优点。
[0095] 本发明的原理(见附图1)是通过在均相条件下将偶联了抗D-二聚体抗体的带有酞 菁染料的感光微球1，包被有二甲基噻吩、蒽等活性分子且带有铕螯合物、偶联了抗D-二聚 体抗体的发光微球2混合。此时偶联了抗D-二聚体抗体感光微球1和偶联了抗D-二聚体抗体 的发光微球2迅速有效地识别检测样本3的目标分子而形成免疫夹心复合物。在激光(波长 为680nm)的照射下，感光微球上的光敏剂将周围环境中的氧气转化为更为活跃的单线态 氧。单线态氧扩散至发光微球，与其上的化学发光剂反应，进一步激活了同样在发光微球上 的荧光基团，使之发出荧光，波长为615nm。单线态氧的半衰期为4ys，在溶液中的扩散距离 为200nm左右。如果生物分子不存在相互作用，单线态氧无法扩散到发光微球，则不会有荧 光信号产生。
[0096] 实施例3
[0097] 与实施例1基本相同，不同之处仅在于所用发光微球为羧基发光微球，所用感光微 球为羧基感光微球；
[0098]经过实施例2方法学进行验证，其线性、准确度、精密度、分析灵敏度、特异性和相 关性与实施例1结果基本相同。
[0099] 实施例4
[0100] 与实施例1基本相同，不同之处仅在于所用发光微球为氨基发光微球，所用感光微 球为氨基感光微球；
[0101] 经过实施例2方法学进行验证，其线性、准确度、精密度、分析灵敏度、特异性和相 关性与实施例1结果基本相同。
【主权项】
1. 一种一步均相D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，包括： (1) 抗D-二聚体抗体偶联的发光微球试液； (2) 抗D-二聚体抗体偶联的感光微球试液； (3) 分析缓冲液； 以及能够接收和发射光的反应孔。2. 根据权利要求1所述的一步均相D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，所述抗D-二聚体 抗体为针对D-二聚体不同表位的单克隆抗体或多克隆抗体。3. 根据权利要求1所述的一步均相D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，所述发光微球表 面活性基团为醛基、羧基或氨基，发光微球带有发光化合物和镧系元素化合物的高分子，发 光微球大小为100-300nm;所述感光微球表面活性基团为醛基、羧基或氨基，感光微球带有 光激发产生单线态氧的染料，感光微球大小为100-300nm。4. 根据权利要求3所述的一步均相D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，所述发光化合物 为二氧杂环己烯或二甲基噻吩的衍生物，镧系元素化合物为Eu(TTA) 3/TOPO或Eu(TTA)3/ Phen;所述染料为酞箐染料或叶绿素。5. 根据权利要求1所述的一步均相D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，所述抗D-二聚体 抗体偶联的发光微球，其中发光微球与抗D-二聚体抗体的质量比为（1-100) :1;所述抗D-二 聚体抗体偶联的发光微球试液的浓度为10-200μg/ml。6. 根据权利要求1所述的一步均相D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，所述抗D-二聚体 抗体偶联的感光微球，其中感光微球与抗D-二聚体抗体的质量比为（1-100): 1;所述抗D-二 聚体抗体偶联的感光微球试液的浓度为10-200μg/ml。7. 根据权利要求1所述的一步均相D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，所述反应孔为微 孔板、微流控试剂盘、反应杯或反应管；所述分析缓冲液的制备，包括如下步骤:将HEPES 0.1-2g、BSA 0.1-5g、Casein 0.1-5g、NaCl 0.5-3g、Triton X-100 0.01-lml加入蒸馏水溶 解后，制成分析缓冲液。8. 根据权利要求1所述的一步均相D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，所述抗D-二聚体 抗体偶联的发光微球试液或抗D-二聚体抗体偶联的感光微球试液主要由以下步骤制成： (1) 将抗体加入到超滤管中，离心，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复洗涤，抗体稀释到lmg/ ml备用;取发光微球或者感光微球，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复清洗两次，离心，去除上清； (2) 将抗体溶液加入到发光微球或感光微球中，重悬； (3) 加入 10%Tween20; (4) 加入400mM NaCNBH3，加入HEPES缓冲液将体积补足； (5) 37°C震荡反应24-48小时； (6) 封闭：用800mMNa0H配制65mg/ml CMO溶液，加到反应体系中； (7) 37°C震荡反应； (8) 尚心，去除上清； (9) 加入Tr i s-HCl (pH8.0)缓冲液重悬，离心，去除上清，重复一次； (10) 最后一次离心后用roS缓冲液和牛血清白蛋白混合液重悬微球，终浓度5mg/ml，使 用前稀释至所需浓度。9. 权利要求1-8任一项所述一步均相D-二聚体检测试剂盒在检测D-二聚体含量中的应 用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，检测方法包括以下步骤： (1) 在试剂盒的反应孔中加入样品、抗D-二聚体抗体偶联的发光微球试液和抗D-二聚 体抗体偶联的感光微球试液，混合反应5-60分钟； (2) 激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得光信号值； (3) 绘制D-二聚体浓度与光信号值的标准曲线，利用步骤(2)测得的光信号值，通过标 准曲线计算D-二聚体含量。
【文档编号】G01N33/577GK105974118SQ201610422173
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年6月13日
【发明人】李明明, 张春东, 黄宝福, 淳林
【申请人】南京普朗医疗设备有限公司