一种同时检测对虾imnv、yhv和tsv的多重pcr检测引物及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及海洋生物病原检测技术，具体涉及一种同时检测对虾传染性肌肉坏死 病毒（Infectious Myonecrosis Virus，IMNV)、黄头病毒（Yellowhead virus，YHV)、桃拉病 毒(Taura Syndrome virus,TSV)的多重PCR检测引物及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 世界动物卫生组织(0ΙΕ)列出了一些对虾主要病毒性病原，其中对虾传染性肌肉 坏死病毒（Infectious Myonecrosis Virus, IMNV)、黄头病毒（Yellowhead virus,YHV)、桃 拉病毒（Taura Syndrome virus, TSV)是对对4下养殖业危害极为严重的甲壳类RNA病毒。 頂NV为双链RNA病毒，无囊膜。发现于南美，2002年巴西发生传染性肌肉坏死病，主要危害南 美白对虾。该病在整个养殖季节可导致对虾累计死亡率为70 %。2003年巴西水产养殖业造 成2000万美元的经济损失，至2005年末，对虾传染性肌肉坏死病给巴西水产养殖业造成的 经济损失达到4.4亿美元。至2010年给印度尼西亚造成超过100万美元的损失。2006年该病 毒已被列入亚太地区水生动物监测季度报告(QAAD)的病害监测名录。目前针对MN还未发 现有效的治疗方法，因此，对该病害主要以防为主，急需建立快速又灵敏的检测方法。
[0003] 黄头病毒是单股1正链RNA病毒，有囊膜，有3层包膜，有细胞质包涵体。主要感染斑 节对4下（P.monodon)、白滨对奸（1^1:叩611&6118 setiferus)、日本对奸（Marsupenaeus japonicus)、墨吉对if(Fenneropenaeus merguiensis)等，其中以斑节对4下最为敏感，斑节 对虾感染后死亡率可达100%，病虾体色发白，头胸部发黄肿大、鳃和肝脏呈淡黄色。淋巴器 官、结缔组织表皮角质坏死，细胞固缩，出现细胞质包涵体。50-70日龄的幼虾最易受感染， 发病后3-5天内死亡率可达100%，给对虾养殖业造成巨大的经济损失。该病毒曾对印度、澳 大利亚、泰国、越南等国家对虾养殖业造成巨大损失。因此为预防及防治TSV的感染，应建立 一种高效的快速、准确、灵敏的检测技术。
[0004] 桃拉病毒(Taura Syndrome Virus，TSV)是单股正链RNA病毒，二十面体，无囊膜， 有包涵体。是一种给对虾养殖业造成极大危害的病原。该病毒可感染的对虾种类繁多，如： 中国对奸$6111161'〇卩611&6118)、凡纳滨对4下(1^1：〇卩611&6118￥&1111&1116；0、斑节对4下(？.1]1〇11〇(1〇11)、 细角滨对奸(L.stylirostris)等。其中以凡纳滨对奸最为敏感，主要发生在奸的銳皮期，感 染率较高，死亡率较大，感染后对虾死亡率为40%-95%。目前对TSV引起的对虾病害尚无有 效的治疗方法，只能以预防为主，因此需依靠早期的快速诊断与筛查方法。
[0005] 在人工养殖中，对虾可同时感染多种病毒。因此常出现多种病毒混合感染，给对虾 养殖业及海洋资源的可持续发展带来严重威胁。对对虾病原性病毒的检测和监控就显得意 义非常重大。
[0006] 目前，对虾病毒病的诊断手段主要包括病理学和生物学方法、免疫诊断法，分子杂 交及PCR。已建立的常规PCR技术，常是一次只能检测一种样本，比较费时间。而多重PCR技术 是一种特殊的PCR方法，在一个反应体系中加入多对病毒特异性引物，能够同时检测多种病 原体，从而缩短病毒检测的周期，提高检测效率。但多重PCR检测也受多种因素的影响，比如 DNA聚合酶的活性、模板的质量、所设计的病毒引物的特异性、PCR反应条件、不同病毒样本 间对试剂的竞争等因素都会影响检测结果的敏感性和准确性。
[0007] 基于当前现状，需建立一种准确、快速、简便的对虾病毒检测方法，以利于对病毒 的早期诊断，便于及时采取有效的防治措施。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一种方便快捷，检测限低，且特异性强、灵敏度高、准确率 高、且能同时检测对虾传染性肌肉坏死病毒、黄头病毒、桃拉病毒的多重PCR检测方法。
[0009] 为实现上述目的，本发明提供一种同时检测对虾传染性肌肉坏死病毒、黄头病毒、 桃拉病毒的多重PCR引物对，其特征在于，所述引物对分别为頂NV-F和頂NV-R、YHV-F和YHV-R、TSV-F和TSV-R，序列依次如SEQ ID N0:1 和2，SEQ ID N0:3和4，SEQ ID N0:5和6所示。
[0010] 本发明还提供一种同时检测对虾传染性肌肉坏死病毒、黄头病毒、桃拉病毒的多 重PCR检测试剂盒，其特征在于，含有所述的引物对。
[0011 ]本发明还提供用所述多重PCR引物或所述多重PCR检测试剂盒中的引物检测对虾 传染性肌肉坏死病毒、黄头病毒、桃拉病毒的用途。
[0012]本发明还提供一种用所述多重PCR引物或所述多重PCR检测试剂盒中的引物检测 对虾传染性肌肉坏死病毒、黄头病毒、桃拉病毒的方法。
[0013] 进一步，步骤为，
[0014] 提取总 RNA;
[0015] 合成 cDNA;
[0016] PCR检测，采用所述多重PCR引物或所述多重PCR检测试剂盒中的引物；阳性对照为 SEQ ID N0:7，SEQ ID N0:8和SEQ ID N0:9的核酸序列混合作为模板，阴性对照为：不含有 对虾传染性肌肉坏死病毒、黄头病毒、桃拉病毒任一病毒的任意cDNA核酸序列。
[0017] 结果判定：
[0018] 当检测样本和阳性对照的扩增条带大小接近，为120-130bp时，结果为对虾传染性 肌肉坏死病毒阳性;如果没有120-130bp条带，则为对虾传染性肌肉坏死病毒阴性；
[0019] 当检测样本和阳性对照的扩增条带大小接近，为220_230bp时，结果为黄头病毒阳 性;如果没有220-230bp条带，则为黄头病毒阴性；
[0020] 当检测样本和阳性对照的扩增条带大小接近，为325-335bp时，结果为桃拉病毒阳 性;如果没有325-335bp条带，则为桃拉病毒阴性；
[0021] 当阴性对照出现条带时，表明操作过程中有试剂污染，检测结果无效；
[0022] 当阳性对照无条带时，表明引物或者试剂盒中试剂降解，引物或试剂盒失效。
[0023] 进一步，所述PCR检测的PCR反应体系为:25yL反应体系中包含有10倍浓度的含镁 离子的Taq DNA聚合酶缓冲液2.5yL，Taq DNA聚合酶0.5yL，各引物终浓度为0.4μΜ，合成好 待检测的cDNA模板100ng。
[0024] 进一步，所述PCR检测的PCR反应条件为：95°C3分钟，1个循环；95°C30秒，56°C30 秒，72°C30秒，35个循环;72°C10分钟，1个循环;4°C保存。
[0025] 本发明根据对it!下传染性肌肉坏死病毒（Infectious Myonecrosis Virus，IMNV)、 黄头病毒(Yellowhead virus,YHV)、桃拉病毒(Taura Syndrome virus,TSV)的核酸序列， 分别设计用于检测传染性肌肉坏死病毒、黄头病毒、桃拉病毒的特异性引物。
[0026]本发明通过对所设计的引物进行实验筛选，筛选出一组同时对传染性肌肉坏死病 毒、黄头病毒、桃拉病毒具有非常高的灵敏性和特异性的引物，引物序列如下：
[0027] 对虾传染性肌肉坏死病毒
[0028] 上游引物：頂NV-F:AAC GTA GCT GCT ATT GGT GTG G SEQ ID N0:1
[0029] 下游引物：頂NV-R:GGC AGT GTT GTT TTC ATT CTT TC SEQ ID N0:2
[0030] 黄头病毒
[0031] 上游引物：YHV-F:CTC GTA TGC AGG CAT CTC CA SEQ ID N0:3
[0032] 下游引物：YHV-R:TCA TTG CGT GGA TAC CTT CAG SEQ ID N0:4
[0033] 桃拉病毒
[0034] 上游引物：TSV-F:CCT GAG GGA TTG GAT GAG ATG T SEQ ID N0:5
[0035] 下游引物：TSV-R:TTC TAT TGG TTG AAC ACC GCT AC SEQ D N0:6
[0036] 阳性质控品
[0037]