一种鉴定猪脊椎数相关性状的方法及专用引物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，设及一种鉴定猪脊椎数相关性状的方法及专用引物。
【背景技术】
[0002] 猪脊椎数是猪的重要经济性状，脊椎数的变异可影响猪的体长，据报道，脊椎数量 每额外增加 1 节，体长可增加约8cm(KingJWB,Robe;rtsRC.Carcasslengthinthebacon pig:itsassociationwithvertebraenumbersandpredictionfromradiographsof theyoungpig.AnimProd. 1960, 2:59-65.)。猪的脊椎可分为颈椎、胸椎、腰椎、荐椎和尾 椎，其中胸椎和腰椎在不同猪种中存在变异，其它椎体数量固定，因此，一般提到脊椎数是 指胸腰椎数。中国地方猪种的脊椎数一般有19-20节，而西方商业猪种一般有20-22节 (MikawaS,HayashiT,NiiM,ShimanukiS,MorozumiT,AwataT.Twoquantitativetrait locionSusscrofachromosoneslandTaffectingthenumberofvertebrae.JAnim Sci. 2005, 83:2247-2254.)。因此，影响脊椎数变异的主效基因研究成为了研究热点之一。
[0003] 基于猪脊椎数相关性状的重要性，针对其开展育种工作成为当前育种工作的一个 重点。但是，由于传统育种方法速度慢、准确程度低，分子育种W其准确性和快速性等特点 已经成为当前育种工作的主要技术手段。
【发明内容】
[0004] 本发明的第一个目的是提供一种与猪脊椎数相关的SNP位点及其应用。
[0005] 本发明所提供的应用具体可为如下中的任一种：（1)猪基因组中如下SNP位点的 单核巧酸多态性在鉴定或辅助鉴定待测猪的脊椎数相关性状中的应用；（2)用于检测猪基 因组中如下SNP位点的单核巧酸多态性的物质在鉴定或辅助鉴定待测猪的脊椎数相关性 状中的应用。
[0006] 所述SNP位点为：W猪基因组DNA为模板，采用由序列表中序列1所示的单链DNA 和序列表中序列2所示的单链DNA组成的引物对进行PCR扩增所得扩增产物的自5'末端 起第118位核巧酸；所述SNP位点处的核巧酸为A或G。
[0007] 该SNP位点位于TGFB3基因内，具体为国际猪基因组10. 2版本参考序列7号染色 体上第105182819个核巧酸位点A〉G突变（记为g. 105182819A〉G)。
[0008] 本发明的第二个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定待测猪的脊椎数相关性状 的试剂。
[0009] 本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定待测猪的脊椎数相关性状的试剂，是用于检 测猪基因组中SNP位点（g. 105182819A〉G)的单核巧酸多态性的物质；
[0010] 所述"用于检测猪基因组中如下SNP位点的单核巧酸多态性的物质"可W能够鉴 定SNP位点（g. 105182819A〉G)的单核巧酸多态性的任何物质，如为如下（a)或化）所示的 引物对： 1] (a)由序列表中序列1所示的单链DNA和序列表中序列2所示的单链DNA组成的 引物对；
[0012] (b)由将序列表中序列1和序列2经过一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/ 或添加后所得序列所示的两条单链DNA分子组成的，且与（a)中所述引物对功能相同的引 物对。
[0013] 本发明的第=个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定待测猪的脊椎数相关性状 的试剂盒。
[0014]本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定待测猪的脊椎数相关性状的试剂盒，含有所 述试剂。
[0015] 所述试剂或所述试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测猪的脊椎数相关性状中的应用也 属于本发明的保护范围。
[0016]本发明的第四个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测猪的脊椎数相关性状的方 法。
[0017] 本发明所提供的鉴定或辅助鉴定待测猪的脊椎数相关性状的方法，具体可包括如 下步骤：检测待测猪的基因组中SNP位点（g. 105182819A〉G)处的核巧酸为A还是G还是A 和G，W确定所述待测猪的基因型是AA还是GG还是AG,根据所述待测猪的基因型按照如下 确定待测猪的脊椎数相关性状：GG基因型的待测猪的脊椎数多于或候选多于AG基因型的 待测猪；AG基因型的待测猪的脊椎数多于或候选多于AA基因型的待测猪；
[0018] 所述GG基因型为W猪基因组DNA为模板，采用由序列表中序列1所示的单链DNA 和序列表中序列2所示的单链DNA组成的引物对进行PCR扩增所得的扩增产物的自5'末 端起第118位核巧酸为G的纯合型（即国际猪基因组10. 2版本参考序列7号染色体上第 105182819个核巧酸为G的纯合型）；即扩增产物只有一种，为序列表中序列4所示DNA片 段。
[0019] 所述AA基因型为W猪基因组DNA为模板，采用由序列表中序列1所示的单链DNA 和序列表中序列2所示的单链DNA组成的引物对进行PCR扩增所得扩增产物的自5'末 端起第118位核巧酸为A的纯合型（即国际猪基因组10. 2版本参考序列7号染色体上第 105182819个核巧酸为A的纯合型）；即扩增产物只有一种，为序列表中序列3所示DNA片 段。
[0020] 所述AG基因型为W猪基因组DNA为模板，采用由序列表中序列1所示的单链DNA 和序列表中序列2所示的单链DNA组成的引物对进行PCR扩增所得扩增产物的自5'末端 起第118位核巧酸为A和G的杂合型（即国际猪基因组10. 2版本参考序列7号染色体上 第105182819个核巧酸为A和G的杂合型）；即扩增产物有两种，分别为序列表中序列3所 示DNA片段和序列表中序列4所示DNA片段。
[OOW 在所述方法中，所述"检测待测猪的基因组中如下SNP位点处的核巧酸为A还是G 还是A和G"的方法可为测序分析；所述测序分析可包括PCR扩增和对所述PCR扩增所得产 物进行测序两个步骤；所述PCR扩增的模板为所述待测猪的基因组DNA，所用的引物对满足 如下条件：W待测猪的基因组DNA为模板进行PCR扩增所得扩增产物含有所述SNP位点处 的核巧酸；
[0022] 具体的，所述引物对可为如上所述（a)或所述化）所示的引物对。
[002引当采用所述引物对（序列1和序列2)进行PCR扩增时，根据待测猪的基因组DNA 的不同，扩增得到的DNA片段如序列表中序列3所示或如序列表中序列4所示。其中，序列 3的第118位核巧酸为A;序列4的第118位核巧酸为G。
[0024] 所述试剂或所述试剂盒或所述方法在猪育种中的应用也属于本发明的保护范围。
[0025] 在所述方法中，进行所述PCR扩增时采用的退火溫度为56-60°C(如58. 5°C)。
[0026] 进一步，进行所述PCR扩增时采用的扩增程序具体为：95°C预变性5min;95°C变性 20s，58. 5°C退火30s，72°C延伸30s，共35个循环；最后72°C延伸lOmin。
[0027] 进一步，所述PCR反应体系具体为：模板DNA200ng，IOXPCR扩增缓冲液5y1， dNTPs终浓度为IOmM,上、下游引物各50ng，TaqDNA聚合酶0. 75U，Mg2么5臟〇1/1，用d地2〇 补足体系至50Ji1。
[0028] 本发明的第五个目的是提供如下（A)或度）的方法：
[0029] (A)培育多脊椎数的猪的方法，包括选择GG基因型的猪进行育种的步骤；所述GG 基因型为W猪基因组DNA为模板，采用由序列表中序列1所示的单链DNA和序列表中序列2 所示的单链DNA组成的引物对进行PCR扩增得到的扩增产物的自5'末端起第118位核巧 酸为G的纯合型（即国际猪基因组10. 2版本参考序列7号染色体上第105182819个核巧 酸为G的纯合型）；
[0030] 做培育少脊椎数的猪的方法，包括选择AA基因型的猪进行育种的步骤；所述GG 基因型为W猪基因组DNA为模板，采用由序列表中序列1所示的单链DNA和序列表中序列2 所示的单链DNA组成的引物对进行PCR扩增得到的扩增产物的自5'末端起第118位核巧 酸为A的纯合型（即国际猪基因组10. 2版本参考序列7号染色体上第105182819个核巧 酸为A的纯合型）。
[0031] 在本发明中，所述猪为大民杂交猪；所述大民杂交猪具体由大白猪和民猪杂交得 到。
[0032] 在本发明中，所述脊椎数是指胸椎数和腰椎数的总和。
[0033] 实验证明，GG基因型的猪的脊椎数显著大于AG基因型的猪的脊椎数，AG基因型 的猪的脊椎数显著大于AA基因型猪的脊椎数，GG基因型猪的脊椎数比AA基因型猪的脊椎 数多约0. 66节（P<0. 001)。所WSNP位点（g. 105182819A〉G)可作为猪脊椎数相关性状的 分子育种标记。本发明提供的方法可对待选猪进行早期筛选，有效地解决实际生产中的选 取优良种猪时间长的问题，降低了育种花费，有效减少或增加实际生产中的猪的脊椎数，该 方法准确度高，检测费用低，并可实现自动化检测，在猪的育种方面具有很高的实践应用价 值。
【附图说明】 W34] 图1为AA基因型个体（对应序列扣和GG基因型个体（对应序列4)猪TGFB3基 因g. 105182819A〉G多态性位点附近序列的测序结果。
【具体实施方式】
[0035] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0036] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0037] 下述实施例中的大民杂交猪（Susscro化)，由大白猪和民猪杂交获得，具体为大 白猪X民猪的F2代，按照文献中的方法获得：Luo W，化eng化化en S，Wang LLi Y，Ma X，Song X，Liu X，Li W, Liang J, Yan H, ZhaoK, Wang C, Wang L, Zhang L. Genome-wide association analysis of meat quality traits in a porcine Large WhiteXMinzhu intercross population. Int J Biol Sci.2012, 8:580-595。具体方法如下：四头大白猪分 别交配16头民猪，获得Fl代群体，此Fl代群体中的9头公猪交配46头母猪，=个胎次共 生产了 592头F2代个体。
[003引