Dna标签、pcr引物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及核酸测序及分型技术领域，具体地，涉及DNA标签、PCR引物及其应用， 更具体地，涉及一组DNA标签、一组PCR引物、构建核酸测序文库的方法、确定DNA样品耳 聋基因是否存在突变的方法、用于确定DNA样品耳聋基因是否存在突变的试剂盒W及确定 DNA样品耳聋基因是否存在突变的系统。
【背景技术】
[0002] 耳聋是一种严重影响生活质量和交流的常见疾病。根据2006年第二次全国残疾 人抽样调查，我国残疾人群8296万，其中听力残疾人群2780万，7岁W下的聋哑儿童高达 80万，并W每年新生3万聋儿的速度增长。婴幼儿聋病发生60% -70%是由遗传因素导致 的。迄今为止，与非综合征型耳聋相关的40个常染色体隐性遗传基因，27个常染色体显性 遗传基因，3个X连锁遗传基因，2个线粒体遗传基因已经被克隆。而每个基因中又有数目 众多的耳聋致病突变位点，其中WGJB2、化C26A4和12SrRNA的突变最为常见，其它基因所 占比例较小。
[0003]国内研究人员也针对中国人群耳聋的突变类型进行了大规模的流行病学调查。根 据近几年的分子流行病学调查，上述3个基因和GJB3的突变比例高达40%。
[0004] 耳聋早期检测的意义：第一时间发现聋病易感基因携带者及迟发型听力损失高危 儿，做到早发现早干预；辅助耳聋病因诊断；检测出药物性耳聋基因携带者，指导抗生素的 应用，避免药物性耳聋的发生；进行流行病学调查。因此耳聋突变基因的早发现对于聋病的 预防和治疗具有重要意义。
[0005]目前传统的耳聋基因检测方法包括单链构象多态性（PCR-SSCP)，限制性片段长度 多态（PCR-RFLP)，变性高效液相色谱分析值HPLC)，直接测序，基因芯片、飞行时间质谱检 测技术等方法。送些检测方法存在较多局限性，或者检测能力低、或者通量低耗时费力、所 需设备和耗材昂贵，更重要的是，送些方法除基因芯片的方法，难W同时将不同基因的多个 突变位点进行高通量的检测，然而基因芯片的平台价钱昂贵，对仪器和人员的素质要求较 高，难W在我国广大医疗机构中普及。
[0006] 并且上文描述的郝些检测方法，通量都较低。当对大规模的样品进行耳聋基因检 测时，应用上述方法是耗时耗力的，并且成本高昂。因此，本领域迫切需要新的高通量、低成 本的耳聋基因检测方法，W实现快速检测和规模化人群检测。
【发明内容】
[0007] 本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的 在于提出一种能够高通量、低成本、快速高效地对DNA样品尤其是多个DNA样品进行耳聋基 因突变检测的方法。
[0008] 因而，根据本发明的一个方面，本发明提供了一组DNA标签。根据本发明实施例的 一组DNA标签，其选自SEQIDNO:1-95所示的核巧酸。本发明的一组DNA标签能够用于 构建核酸测序文库，W精确地对核酸测序文库进行区分。利用上述DM标签（在本文中有 时也称为"核酸标签"），通过将DNA标签与DNA或其等同物相连，可W精确地表征DNA的样 品来源。由此，利用上述DNA标签，可W同时构建多种DNA样品的用于测序的核酸测序文库 (在本文中，有时也称为DNA标签文库），从而可W通过将来源于不同样品的核酸测序文库 进行混合，同时进行测序，基于DNA标签对获得的测序序列进行分类，获得多种DNA样品的 序列信息。从而可W充分利用高通量的测序技术，例如利用Solexa测序技术，同时对多种 DNA进行测序，从而提高DNA测序的效率和通量。
[0009] 根据本发明的另一方面，本发明还提供了一组PCR引物。根据本发明实施例的一 组PCR引物，其选自SEQ ID NO =96-119所示的核巧酸。本发明的一组PCR引物分别与耳聋 基因GJB2、GJB3、SLC26A4和12S rRNA特异相关，利用该组PCR引物将DNA样品进行多重 PCR扩增，能够一步多重PCR扩增12个耳聋基因片段，经过测序即可快速获取其DNA序列， 耳聋基因检测通量高，突变位点分辨能力和灵敏度好。
[0010] 根据本发明的再一方面，本发明还提供了一组标签PCR引物。根据本发明实施例 的一组标签PCR引物，其是通过将前面所述的一组DNA标签中的任意一种连接至前面所述 的一组PCR引物的5'末端而获得的。因而，本发明的一组标签PCR引物，可W有95种形式， 进而利用本发明的一组标签PCR引物最多可W-次对95种DNA样品进行耳聋基因的突变 检测。
[0011] 根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种构建核酸测序文库的方法。根据本 发明的实施例，该方法包括W下步骤：将DNA样品进行多重PCR扩增，W便获得PCR扩增产 物，其中所述多重PCR扩增采用前面所述的一组标签PCR引物进行；W及纯化回收所述PCR 扩增产物，所述PCR扩增产物构成所述核酸测序文库。利用该方法，能够有效地将根据本发 明实施例的DNA标签引入到针对DNA样品所构建的用于确定DNA样品耳聋基因是否存在突 变的核酸测序文库中，从而可W通过对核酸测序文库进行测序，获得DNA样品的核酸测序 文库的序列信息W及DNA标签的序列信息，从而能够对多种DNA样品的核酸测序文库的序 列信息的来源进行区分，进而能够有效确定所述多种DNA样品的每一种的核酸测序文库的 序列信息，从而能够分别确定多种DNA样品耳聋基因是否存在突变，提高了耳聋基因突变 检测的通量、效率和准确度。
[0012] 根据本发明的实施例，所述构建核酸测序文库的方法进一步包括；将所述核酸测 序文库依次进行末端修复、3'末端添加碱基A、连接测序接头W及纯化回收连接产物的步 骤。
[0013] 根据本发明的再一方面，本发明还提供了一种确定DNA样品耳聋基因是否存在突 变的方法。根据本发明的实施例，该方法包括W下步骤；根据前面所述的构建核酸测序文库 的方法，构建所述DNA样品的核酸测序文库；对所述核酸测序文库进行测序，W便确定所述 DNA样品的核酸测序文库的序列信息；W及基于所述DNA样品的核酸测序文库的序列信息， 确定所述DNA样品耳聋基因是否存在突变。基于该方法，能够有效地对DNA样品进行耳聋 基因突变检测，确定所述DNA样品耳聋基因是否存在突变。
[0014] 根据本发明实施例，所述耳聋基因为GJB2、GJB3、SLC26A4和12SrRNA的至少一 种。
[0015] 根据本发明的实施例，利用Solexa、SOLID、单分子和454测序平台的至少一种对 所述核酸测序文库进行测序。由此，测序通量高，检测结果准确可靠。
[0016] 根据本发明的实施例，基于所述DNA样品的核酸测序文库的序列信息，确定所述 DNA样品耳聋基因是否存在突变，进一步包括；将所述DNA样品的核酸测序文库的序列信 息与参考数据库进行比对；基于比对结果，确定所述DNA样品耳聋基因是否存在突变。根 据本发明的一些具体示例，所述参考数据库为耳聋基因数据库，优选来自HGMD和http:// de曰fnessv曰ri曰tiond曰t曰b曰Se.com/o
[0017] 根据本发明实施例，所述DNA样品为多种，所述多种为2-95种，所述方法包括W下 步骤；针对所述多种DNA样品的每一种，分别独立地根据前面所述的方法构建所述DNA样 品的核酸测序文库，其中，不同的DNA样品采用相互不同的DNA标签；将所述多种DNA样品 的核酸测序文库进行混合，W便获得核酸测序文库混合物；对所述核酸测序文库混合物进 行测序，W便获得所述多种DNA样品的核酸测序文库的序列信息W及所述DNA标签的序列 信息；基于所述DNA标签的序列信息对所述多种DNA样品的核酸测序文库的序列信息进行 分类，W便确定所述多种DNA样品的每一种的核酸测序文库的序列信息；W及基于所述多 种DNA样品的每一种的核酸测序文库的序列信息，分别确定所述多种DNA样品耳聋基因是 否存在突变。由此，能够同时构建多种DNA样品的用于耳聋基因突变检测的核酸测序文库， 从而可W通过将来源于不同样品的核酸测序文库进行混合，同时进行测序，基于DNA标签 对DNA样品的核酸测序文库的序列信息进行分类，获得多种DNA样品的核酸测序文库的序 列信息。从而可W充分利用Solexa、SOLID、单分子和454测序平台的至少一种，同时对多 种DNA进行测序和耳聋基因突变检测，从而提高了检测的效率和通量。
[0018] 根据本发明的实施例，基于所述多种DNA样品的每一种的核酸测序文库的序列信 息，分别确定所述多种DNA样品耳聋基因是否存在突变，进一步包括：将所述多种DNA样品 的每一种的核酸测序文库的序列信息，分别与参考数据库进行比对；基于比对结果，分别确 定所述多种DNA样品耳聋基因是否存在突变。根据本发明的一些具体示例，所述参考数据 库为耳聋基因数据库，优选来自HGMD和ht1:p://deafnessva;riationdat油ase.com/。
[0019] 根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种用于确定DNA样品耳聋基因是否存 在突变的试剂盒。根据本发明实施例的试剂盒，其包括；一组DNA标签，所述DNA标签选自 沈QIDNO:1-95所示的核巧酸；W及一组PCR引物，所述PCR引物选自沈QIDNO=96-119 所示的核巧酸。由此，利用该试剂盒，能够方便地利用本发明的DNA标签和PCR引物构建标 签PCR引物，进而利用标签PCR引物，根据本发明的确定多种DNA样品耳聋基因是否存在突 变的方法，一次性最多能够实现95种DNA样品的耳聋基因突变检测。
[0020] 根据本发明实施例，所述耳聋基因为GJB2、GJB3、SLC26A4和12SrRNA的至少一 种。
[0021] 根据本发明的再一方面，本发明还提供了一种用于确定D