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[0051]其中，F表示正向引物，R表示反向引物，相同编号的F与R-一对应，例如Fl与 RUF12与R12分别为相应的正、反向引物。del表示缺失，〉表示点突变，如G〉A表示碱基 G突变为A。
[0052] 需要说明的是，发明人采用琼脂糖凝胶电泳和测序法对上述引物进行实验验证， 即对扩增产物进行检测，验证了扩增序列的准确性，证明了本发明的PCR引物的可用性。
[0053] 本发明的一组PCR引物是针对表2耳聋基因的突变区域的特异性引物，利用该组 PCR引物将DNA样品进行多重PCR扩增，最多能够一步多重PCR扩增12个耳聋基因片段，其 中PCR引物及其相应的扩增产物的序列如表2所示，经测序即可快速获取其DNA序列，耳聋 基因检测通量高，突变位点分辨能力和灵敏度好。
[0054] 并且，将本发明的一组PCR引物的5'末端连接上前面所述的DNA标签，即可获得标 签PCR引物，从而利用该标签PCR引物，能够有效地将DNA标签引入到DNA或其等同物中， 并且当针对相同的样品，采用不同的标签引物，构建含有各种DNA标签的核酸测序文库时， 所得到的数据结果的稳定性和可重复性非常好。
[00巧]因而，根据本发明的再一方面，本发明还提供了一组标签PCR引物。根据本发明实 施例的一组标签PCR引物，其是通过将前面所述的一组DNA标签中的任意一种连接至前面 所述的一组PCR引物的5'末端而获得的。因而，本发明的一组标签PCR引物（在本文中有 时也称为"标签引物"），可W有95种形式，进而利用本发明的一组标签PCR引物最多可W 一次对95种DNA样品进行耳聋基因的突变检测。
[0056] 本发明的一组标签PCR引物组（在本文中有时也称为"标签引物组"），其包含24 种标签引物，所述标签引物的序列包含标签序列和PCR引物序列，并且所述标签序列，任选 地连接至所述PCR引物序列的5'端，其中所述标签序列选自SEQIDNO:1-95的任意一种， 且标签引物组中的24种标签引物的每一种的标签序列都相同，所述24种标签引物的PCR 引物序列分别如表2的SEQIDNO=96-119所示。
[0057] 本发明的标签引物组可扩增出12种大约200bp的产物，其对应于耳聋基因的外显 子区域的目的DNA序列。因此，本发明的标签引物组可用于耳聋基因突变检测。
[0058] 在一个优选实施方案中，本发明的标签引物组可用于耳聋基因测序、检测，从而其 可用于检测耳聋基因突变类型，W及构建耳聋基因突变数据库，研究耳聋基因突变类型分 布的地域性特点和流行病学研究等。在另一个优选实施方案中，本发明的标签引物组可用 于制备试剂盒，所述试剂盒可用于耳聋基因测序、检测。
[0059] 此外，本发明的一组标签PCR引物还可W表现为标签引物套组的形式，即其包含 至少10个，优选至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至 少80个、至少90个或95个上文描述的标签引物组。优选地，标签引物套组中，各个标签 引物组所使用的标签序列互不相同。更优选，标签引物套组中所使用的标签序列至少包括 沈9 10側；1-10，或沈910側；11-20，或沈9 10側；21-30，或沈9 10側；31-40，或沈9 10側；41-50，或沈9 10側；51-60，或沈9 10側；61-70，或沈9 10側；71-80，或沈9 10 NO;81-90,或SEQIDNO:91-95所示的标签序列，或者它们任何两个或者多个的组合，例如 沈QIDNO:1-95所示的标签序列。
[0060] 根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种用于确定DNA样品耳聋基因是否存 在突变的试剂盒。根据本发明实施例的试剂盒，其包括；95种DNA标签，所述DNA标签选自 沈QIDNO:1-95所示的核巧酸；W及24种PCR引物，所述PCR引物选自沈QIDNO:96-119 所示的核巧酸。由此，利用该试剂盒，能够方便地利用本发明的DNA标签和PCR引物构建标 签PCR引物，进而利用标签PCR引物，根据本发明的确定多种DM样品耳聋基因是否存在突 变的方法，最多能够一次性实现对95种DNA样品的耳聋基因突变检测。
[0061] 根据本发明实施例，所述耳聋基因为GJB2、GJB3、化C26A4和12SrRNA。
[0062] 根据本发明的另一些实施例，本发明的试剂盒，其包含上文描述的标签引物组或 标签引物套组。由此，本发明的试剂盒可用于高通量耳聋基因突变检测。
[0063] 进而，本发明提供了用于对一个或多个样品进行耳聋基因突变检测的方法。所述 方法包括使用上文描述的标签引物组或标签引物套组或试剂盒对各个样品的DNA进行扩 增、构建测序文库，然后进行测序W获得样品的测序文库序列的步骤。具体地：
[0064] 根据本发明的再一方面，本发明还提供了一种用于确定DNA样品耳聋基因是否存 在突变的试剂盒。根据本发明实施例，所述试剂盒设置有前面所述的一组标签PCR引物。由 此，利用该试剂盒，能够方便地利用本发明的DNA标签和PCR引物构建标签PCR引物，进而 利用标签PCR引物，根据本发明的确定多种DNA样品耳聋基因是否存在突变的方法，一次性 最多能够实现95种DNA样品的耳聋基因突变检测。
[006引根据本发明实施例，所述耳聋基因为GJB2、GJB3、SLC26A4和12SrRNA的至少一 种。根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种构建核酸测序文库的方法。根据本发明 的实施例，该方法包括W下步骤：将DNA样品进行多重PCR扩增，W便获得PCR扩增产物，其 中所述多重PCR扩增采用前面所述的一组标签PCR引物进行；W及纯化回收所述PCR扩增 产物，所述PCR扩增产物构成所述核酸测序文库。利用该方法，能够有效地将根据本发明实 施例的DNA标签引入到针对DNA样品所构建的用于确定DNA样品耳聋基因是否存在突变的 核酸测序文库中，从而可W通过对核酸测序文库进行测序，获得DNA样品的核酸测序文库 的序列信息W及DNA标签的序列信息，从而能够对多种DNA样品的核酸测序文库的序列信 息的来源进行区分，进而能够有效确定所述多种DNA样品的每一种的的核酸测序文库的序 列信息，从而能够分别确定多种DNA样品耳聋基因是否存在突变，提高了耳聋基因突变检 测的通量、效率和准确度。
[0066] 根据本发明的实施例，所述构建核酸测序文库的方法进一步包括；将所述核酸测 序文库依次进行末端修复、3'末端添加碱基A、连接测序接头W及纯化回收连接产物的步 骤。
[0067] 根据本发明的再一方面，本发明还提供了一种确定DNA样品耳聋基因是否存在突 变的方法。
[0068] 根据本发明的实施例，该方法包括W下步骤；根据前面所述的构建核酸测序文库 的方法，构建所述DNA样品的核酸测序文库；对所述核酸测序文库进行测序，W便确定所述 DNA样品的核酸测序文库的序列信息；W及基于所述DNA样品的核酸测序文库的序列信息， 确定所述DNA样品耳聋基因是否存在突变。基于该方法，能够有效地对DNA样品进行耳聋 基因突变检测，确定所述DNA样品耳聋基因是否存在突变。
[0069] 根据本发明实施例，其中所述耳聋基因为GJB2、GJB3、SLC26A4和12SrRNA的至少 一种。
[0070] 根据本发明的实施例，利用Solexa、SOLID、单分子和454测序平台的至少一种对 所述核酸测序文库进行测序。由此，测序通量高，检测结果准确可靠。
[0071] 根据本发明的实施例，基于所述DNA样品的核酸测序文库的序列信息，确定所述 DM样品耳聋基因是否存在突变，进一步包括；将所述DM样品的核酸测序文库的序列信 息与参考数据库进行比对；基于比对结果，确定所述DNA样品耳聋基因是否存在突变。根 据本发明的一些具体示例，所述参考数据库为耳聋基因数据库，优选来自HGMD和http:// de曰fnessv曰ri曰tiond曰t曰b曰Se. com/o
[007引根据本发明的实施例，参照图1，当所述DNA样品为多种，所述多种为2-95种时，该 方法包括W下步骤：
[0073] SlOO ;针对多种DNA样品的每一种分别独立地构建核酸测序文库
[0074] 针对所述多种DNA样品的每一种，分别独立地根据前面所述的构建核酸测序文库 的方法构建所述DNA样品的核酸测序文库，其中，不同的DNA样品采用相互不同的DNA标 签。
[00巧]S200 ;将多种DNA样品的核酸测序文库进行混合
[0076] 将所述多种DNA样品的核酸测序文库进行混合，W便获得核酸测序文库混合物。
[0077]S300;对核酸测序文库混合物进行测序
[0078] 对所述核酸测序文库混合物进行测序，W便获得所述多种DNA样品的核酸测序文 库的序列信息W及所述DNA标签的序列信息。
[0079]S400;对多种DNA样品的核酸测序文库的序列信息进行分类
[0080] 基于所述DNA标签的序列信息对所述多种DNA样品的核酸测序文库的序列信息进 行分类，W便确定所述多种DNA样品的每一种的核酸测序文库的序列信息。
[0081]S500;确定多种DNA样品耳聋基因是否存在突变
[0082] 基于所述多种DNA样品的每一种的核酸测序文库的序列信息，分别确定所述多 种DNA样品耳聋基因是否存在突变。根据本发明的实施例，基于所述多种DNA样品的每 一种的核酸测序文库的序列信息，分别确定所述多种DNA样品耳聋基因是否存在突变，进 一步包括；将所述多种DNA样品的每一种的核酸测序文库的序列信息，分别与参考数据 库进行比对；基于比对结果，分别确定所述多种DNA样品耳聋基因是否存在突变。根据 本发明的一些具体示例，所