一种与马氏珠母贝生长性状关联的snp标记及引物和应用
【专利摘要】本发明公开了一种与马氏珠母贝生长性状关联的SNP标记及引物和应用。检测引物包括：ASSN1184FI、ASSN1184RI、ASSN1184FO、ASSN1184RO。利用本发明的与马氏珠母贝生长性状相关联的SNP标记的检测引物，能够扩增出与马氏珠母贝生长性状关联的SNP基因型位点，再根据PCR扩增电泳图可直观地筛选出生长优势个体用作后备亲本进行育种，实现分子标记辅助育种。
【专利说明】
一种与马氏珠母贝生长性状关联的SNP标记及引物和应用
技术领域：
[0001] 本发明属于水产动物遗传及分子标记辅助育种技术领域，具体涉及一种与马氏珠 母贝生长性状关联的SNP标记及引物和应用。
【背景技术】：
[0002] 马氏珠母贝是我国及世界上海水珍珠养殖的主要物种。我国自1965年成功地开展 了马氏珠母贝人工育苗以来，海水珍珠产业发展迅速，已成为广东、广西及海南部分沿海地 区海水养殖支柱产业之一。近10多年，我国海水珍珠的质量和产量明显下降，国际竞争力减 弱，养殖经济效益下滑。究其原因，除了养殖环境恶化、养殖技术落后外，还有一个重要原因 是：多年来不注重种贝的选育和保留，缺乏优良品种;种苗质量参差不齐，育珠母贝性状退 化，如生长慢、个体小型、育珠能力减弱等。为了我国海水珍珠养殖业的健康稳定发展，培育 适合我国海区养殖的马氏珠母贝优良品种已迫在眉睫。
[0003] 育种技术有杂交、选择育种，生物技术育种及分子育种等多种方法。分子育种是目 前国内外研究的热点，是育种技术发展的主要方向，它具有高效、快捷的特点。分子育种离 不开分子标记的开发，单核苷酸多态性(Single Nucleotide PolymorphiSm,SNP)是由基因 组水平上单一碱基对变异引起DNA序列多态性(Sachidanandam et al. ,2001)，它是继RFLP 和SSR分子标记后发展起来的第三代分子标记。满足SNP的条件应该是其中的一个等位基因 在群体中的出现的频率应为不小于l%(Kang et al.，2002)。这种变异包括单个碱基的转 换（同型碱基互换）、颠换（异型碱基互换）、插入和缺失，但一般所指的SNP不包括后面两种 情况。目前所发现的SNP，绝大部分都只有2种核苷酸，三种以上的核苷酸共存在一个种群中 几乎不存在，因此SNP是二等位基因多态性。SNP标记具有分布广泛、遗传稳定和二态性等特 点，因此在人类的疾病的致病机制和治疗、重要农作物和家畜遗传育种中取得了巨大的成 效。尤其是近几年来，利用高通量R〇che454测序技术获得大量SNP位点并进行与性状的关联 分析及发现新基因的报道，表明SNP标记已经成为遗传学及MAS主要的工具。而在水产养殖 动物中，利用SNP标记进行MAS育种技术还处在早期阶段，如群体遗传多样性分析、品种鉴 定、性状关联分析、遗传连锁图谱构建和QTL定位等遗传育种领域方面。分子标记的出现为 实现基因型选择提供了可能，因为分子标记的基因型是可以识别的。如果目标基因与某个 分子标记紧密连锁，那么通过对分子标记的基因型进行检测，就能够获得目标基因的基因 型。因此，可以借助分子标记对目标性状的基因型进行选择，这就是分子标记辅助选择 (marker-assisted seIection ,MAS)。与常规育种方法相比，MAS具有明显的优越性，尤其是 对于那些难于测量、遗传力较低和在后期才能表现得性状，且MAS不易受环境的影响，没有 性别和年龄的限制，因此，MAS可在早期进行选择，缩短世代间隔，进而提高选择的强度和育 种的效率(Lande and Thompson, 1990)。而目前，发掘与马氏珠母贝生长性状关联的SNP标 记还很少报道，本发明的目的是提供一种新的与马氏珠母贝生长性状关联的SNP标记，提供 一种活体鉴定该SNP的方法，以利于进行基因型选择育种实践，使基因型选择育种技术具有 实际可操作性。
【发明内容】
：
[0004] 本发明的第一个目的是提供一种与马氏珠母贝生长性状关联的SNP标记的检测引 物。
[0005] 本发明的与马氏珠母贝生长性状关联的SNP标记的检测引物，其特征在于，包括以 下引物：
[0006] ASSNl184FI:5 '-CGATTTGCTAGAAAGCCATTA-3 '；
[0007] ASSNl184RI:5 '-AATTTGTTACAACTTACCTATAATGCAA-3 '；
[0008] ASSNl184F0:5 '-GGTAAAACATTAACACGGATTGA-3 '；
[0009] ASSNl184R0:5 '-ATTGTAATGACTTACCTAAAACGGAT-3 '。
[0010] 本发明的第二个目的是提供一种与马氏珠母贝生长性状关联的SNP标记，其特征 在于，所述的SNP标记的序列如SEQ ID NO. 1所示，全长为llOObp，所述的SEQ ID NO. 1所示 序列自5'端起第457位碱基为A或T，在SEQ ID NO. 1序列中用w表示该位点。
[0011] 具体如下所示：
[0012] GTGCATGTCCACTTGATGCGACCACTAAAACAGATGCAATAATTGCGAAAGATCGTGCCAAACTAAAATATTTCGAT CGCAAAGTGGTCGTGCACCAAATGAGGAGGGGGCTTTAAAAATGTGATGGCATTTCAGAGAAATATAACTTGGGTTG ATTTTGGTTAGATATGAGAAGGTAAAACATTAACACGGATTGATGGTATTTGGGACAGCTGAAAGTAGATATGAAAA ATAAATACATGTACTGGGTTCGTAGTGAATAAAGTGGAGGGAGGGATATTCAGTACCCTTGTAGTTTGACGTCTTGC TGTTTGACTGTGATGATGTTTTCATATTGTAGGAGATCGTGCTGGTAGTATTCTTTGGCCTGGAGTACGTAGTACGC TTATGGGCAGCAGGCTGTCGTAGTAAATACATTGGTGTTAGAGGACGTCTACGATTTGCTAGAAAGCCAATW(W为A 或T)TCCATTATAGGTAAGTTGTAACAAATTTAAGGTGTTGACCGCCGCCGCCCCCTCCTCTGTCATATCTCTTATG TCCGTCTCCCGATTCGTCTGTGTATTACAAAATGTTATAATCCCCACTAAGAGGCTCTAAATTTCTCCGACCGTTAG AGAGCAAATATCCGTTTTAGGTAAGTCATTACAATTTTTTAGCTTAGCTTCCCTTCCCTACCTAGTCAATGCCTTGT CCGTCTCTCATCTCGTCTGTGTATTATAGAAAACTGCTTTCTCCACACTGAGGCTCCCTATTTTCACCAACAGAGAG TTAGAACAAATATGAGATAGCCCCCTTCCCTTCCTGTCCCATCTCTTGTCCGTCTTTCAGTTTGTCTGTGTATTACA GAAAACTGCAACCTCCACTTGCATATGTAGAGGCTCCCAATTTTCACACACAGAGACACATGATTCGATATAAGAAT CATTAACTCTTTATGTCTTTTACCTTTGCAAATTGTCGTTATTTACGTCTGCAGGTCGACCAGAGCGTCCCGTTACT AGTAGATTAACTTTTTTTAGCAGTGTAAATAATCATGCGTGGAAAAAAGCGTCCTTACCATCTAAATGTCATCGTTA AAGCATCGAATCAATACGGTACGGGAACCGTo
[0013] 本发明的第三个目的是提供与马氏珠母贝生长性状关联的SNP标记在马氏珠母贝 分子标记辅助育种中的应用。
[0014] 本发明的第四个目的是提供一种检测马氏珠母贝具有生长优势的个体的方法，其 特征在于，通过对待测马氏珠母贝中的上述与马氏珠母贝生长性状关联的SNP标记进行检 测，确定所述待测马氏珠母贝是否为具有生长优势的个体，确定其是否作为后备亲本进行 育种。
[0015]优选，具体步骤为：
[0016] a、提取待测马氏珠母贝样品基因组DNA;
[0017] b、采用上述的检测引物 ASSNl 184FI、ASSN1184RI、ASSN1184F0、ASSN1184R0 对马氏 珠母贝样品基因组DNA进行PCR扩增；
[0018] C、根据PCR扩增产物对马氏珠母贝样品进行基因型分型，当只出现310bp大小1条 带的为TT基因型，该马氏珠母贝样品判别为具有生长优势的个体，作为后备亲本进行育种。
[0019] 优选，所述的PCR扩增，其PCR反应体系为：25yL;PCR反应体系如下：包含马氏珠母 贝样品基因组DNA 40ng，I X PCR Mixture，检测引物ASSNl 184FI、ASSN1184RI各0 · 8μΜ， ASSNl 184F0、ASSNl 184R0各0 · 2μΜ，0 · IU Taq DNA酶，余量为水；反应条件为：94°C，4min; 94 °C30s，57°C30s，72°C45s，35 个循环；72°C 延伸 lOmin。
[0020] 优选，所述的提取待测马氏珠母贝样品基因组DNA是提取待测马氏珠母贝样品的 鳃组织的基因组DNA。
[0021] 本发明的第五个目的是提供一种用于检测与马氏珠母贝生长性状关联的SNP标记 的试剂盒，其特征在于，包括上述的与马氏珠母贝生长性状关联的SNP标记的检测引物。 [0022]利用本发明的与马氏珠母贝生长性状相关联的SNP标记的检测引物，能够扩增出 与马氏珠母贝生长性状关联的SNP基因型位点，再根据PCR扩增电泳图可直观地筛选出生长 优势个体用作后备亲本进行育种，实现分子标记辅助育种。
【附图说明】：
[0023]图1是与马氏珠母贝生长性状关联的SNP标记的扩增电泳图，其中泳道1-12和泳道 14-25为马氏珠母贝样品，13为DL2000Maker，条带从上往下依次为2000bp，1000bp，750bp， 500bp，250bp，IOObp。
【具体实施方式】：
[0024]以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0025] 实施例1:
[0026]随机取来自于同一群体的120个马氏珠母贝个体，清洗干净后，测量每个贝的生长 性状(壳高、壳长、壳宽和体重），用开口器打开贝壳，用剪刀剪取一块鳃组织置于95%乙醇 中，于-20°C保存，--对应记录，将取样后的贝继续养殖。使用HiPure Universal DNA Kit (广州美基生物公司）对来自120个马氏珠母贝的鳃组织的基因组DNA进行提取，相关操作参 见试剂盒说明书进行。DNA提取后，于1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，紫外分光光度 计测量DNA的浓度和纯度，于-20 °C保存。
[0027]与马氏珠母贝生长性状相关联的SNP标记的检测引物为：
[0028] ASSNl184FI:5 '-CGATTTGCTAGAAAGCCATTA-3 '；
[0029] ASSNl184RI:5 '-AATTTGTTACAACTTACCTATAATGCAA-3 '；
[0030] ASSNl184F0:5 '-GGTAAAACATTAACACGGATTGA-3 '；
[0031 ] ASSNl184R0:5 '-ATTGTAATGACTTACCTAAAACGGAT-3 '。
[0032]用上述引物 ASSNl 184FI、ASSN1184RI、ASSN1184F0、ASSN1184R0 对马氏珠母贝样品 基因组DNA在PCR仪上进行PCR扩增。PCR反应体系如下:扩增体系25yL，包含马氏珠母贝样品 基因组DNA 0.5yL(40ng)，10XPCR Mixture 2·5μL，10μΜ检测引物ASSN1184FI、ASSN1184RI 各2yL，ΙΟμΜ检测引物ASSNl 184F0、ASSN1184R0各0 · 5yL，0 · IU Taq DNA酶（Takara公司），双 蒸水补足至 25yL。反应条件为:94°(：，411^11;941€3〇8,57 1€3〇8,721€458,35个循环；72°(：延伸 10min〇
[0033] PCR产物用3%琼脂糖(广州康龙科技生物公司)凝胶电泳，用凝胶成像系统观察电 泳图谱。分型电泳图如图1所示，出现具有310bp和206bp大小2条带的为AT基因型（泳道3,4， 6,8,9，10，11，12，15，17，18,23)，只出现31(^?大小1条带的为1'1'基因型（泳道1，2,5,7,21， 22,24)，只出现206匕?大小1条带的为4六基因型（泳道14，16，19,20,25)。在这120个个体中， TT基因型个体22个，壳高、壳长、壳宽和体重分别为62.39cm、62.93cm、23.88cm、38.98g，AT 基因型个体59个，壳高、壳长、壳宽和体重分别为61.29cm、62.78cm、23.56cm、37.22g，AA基 因型个体37个，壳高、壳长、壳宽和体重分别为58.80cm、59.80cm、23.23cm、33.8g，具有TT基 因型的个体的生长性状值最大，AT基因型个体的生长性状值次之，AA基因型个体的性状值 最小。利用SPSS19.0软件中的一般线性模型(GLM)进行标记与生长性状的相关性分析，基因 型对应性状均值之间的差异用Duancan进行多重比较分析，TT基因型个体的壳高、壳长、壳 宽和体重显著大于AT基因型个体和AA基因型个体(P<0.05)，即认为它们之间具有显著的 统计学差异。有利基因型为TT，可挑选出TT基因型的个体作为后备亲本，以培育优良后代。
【主权项】
1. 一种与马氏珠母贝生长性状关联的SNP标记的检测引物，其特征在于，包括以下引 物： ASSN1184FI:5 '-CGATTTGCTAGAAAGCCATTA-3 '； ASSN1184RI:5 '-AATTTGTTACAACTTACCTATAATGCAA-3 '； ASSN1184F0:5 '-GGTAAAACATTAACACGGATTGA-3 '； ASSN1184R0:5 '-ATTGTAATGACTTACCTAAAACGGAT-3 '。2. -种与马氏珠母贝生长性状关联的SNP标记，其特征在于，所述的SNP标记的序列如 SEQ ID NO. 1所示，所述的SEQ ID NO. 1所示序列自5'端起第457位碱基为AST。3. 权利要求2所述的与马氏珠母贝生长性状关联的SNP标记在马氏珠母贝分子标记辅 助育种中的应用。4. 一种检测马氏珠母贝具有生长优势的个体的方法，其特征在于，通过对待测马氏珠 母贝中的权利要求2所述的与马氏珠母贝生长性状关联的SNP标记进行检测，确定所述待测 马氏珠母贝是否为具有生长优势的个体，确定其是否作为后备亲本进行育种。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括以下步骤： a、 提取待测马氏珠母贝样品基因组DNA; b、 采用权利要求 1 所述的检测引物 ASSN1184FI、ASSN1184RI、ASSN1184F0、ASSN1184R0 对马氏珠母贝样品基因组DNA进行PCR扩增； c、 根据PCR扩增产物对马氏珠母贝样品进行基因型分型，当只出现310bp大小1条带的 为TT基因型，该马氏珠母贝样品判别为具有生长优势的个体，作为后备亲本进行育种。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的PCR扩增，其PCR反应体系为:25yL; PCR反应体系如下：包含马氏珠母贝样品基因组DNA 40ng，lXPCR Mixture，检测引物 ASSN1184FI、ASSN1184RI各0·8μΜ，ASSN1184F0、ASSN1184R0各0·2μΜ，0· 1U Taq DNA酶，余量 为水;反应条件为:94°(：，411^11;941€3〇8,57 1€3〇8,721€458,35个循环；72°(：延伸1〇11^11。7. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的提取待测马氏珠母贝样品基因组 DNA是提取待测马氏珠母贝样品的鳃组织的基因组DNA。8. -种用于检测与马氏珠母贝生长性状关联的SNP标记的试剂盒，其特征在于，包括权 利要求1所述的与马氏珠母贝生长性状关联的SNP标记的检测引物。
【文档编号】C12N15/11GK106086216SQ201610674361
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年8月16日 公开号201610674361.3, CN 106086216 A, CN 106086216A, CN 201610674361, CN-A-106086216, CN106086216 A, CN106086216A, CN201610674361, CN201610674361.3
【发明人】何毛贤, 韦国建
【申请人】中国科学院南海海洋研究所