用于检测食品中副溶血性弧菌和整合子的试剂盒与方法【专利摘要】本发明公开了一种检测食品中副溶血性弧菌和整合子的引物、探针、试剂盒及方法，引物的序列为：上游引物VPF：GCCACACTGGAACTGAGACA下游引物VPR：GGAGTTAGCCGGTGCTTCTT；所述整合子引物的序列为：上游引物int1F：CATCGTCGTAGAGACGTCGG下游引物Int1R：AGAACAAGCAGGCATCACGA。本发明试剂盒中引物、探针以及其它组分、配合合理，使用方便，检测快捷，准确；本发明方法操作简便、快速，成本低，检测结果准确。【专利说明】用于检测食品中副溶血性弧菌和整合子的试剂盒与方法
技术领域：
[0001]本发明涉及一种检测食品中副溶血性弧菌和整合子的引物，以及与该引物配合使用的探针;本发明还涉及一种包含上述引物和探针的双重微滴式数字PCR检测试剂盒，本发明还涉及一种采用上述试剂盒检测食品中副溶血性弧菌及整合子inti的方法。【
背景技术：
】[0002]副溶血性弧菌VibrioParahemolyticus，为革兰氏阴性杆菌，呈弧状、杆状、丝状等多种形状，无牙孢。进食含有该菌的食物可致食物中毒，也称嗜盐菌食物中毒。副溶血性弧菌是一种海洋细菌，主要来源于鱼、虾、蟹、贝类和海藻等海产品。副溶血性弧菌主要通过食物传播，其往往需要繁殖到一定数量才会致病，通常导致身体健康的成年人感染发病，需要每克食物含有超过IO6个副溶血性弧菌。由于副溶血性弧菌本身嗜温暖、潮湿、高盐环境，炎热的夏季、海鲜消费增加正有利于其繁殖。[0003]副溶血性弧菌污染食品可有多种途径，一是生食或未煮熟海产品感染，这是人群最主要的感染途径。副溶血性弧菌在海产鱼、贝类运输或贮存条件适宜时即可大量繁殖，迅速达到致病载量;二是交叉污染。烹调过的食物盛于被副溶血性弧菌污染的容器内，或使用被细菌污染的厨具加工其他食品时，可引起食物交叉污染，进而造成进食者感染致病。食品安全国家标准GB29921《食品中致病菌限量》规定，副溶血性弧菌在熟制水产品、生食水产品、即食藻类制品三类食品中的限量值均为IO2-l〇3MPN/g(约IO2-103CFU/g，二者差别在于检验方法不同）。[0004]英国公共卫生实验室食品安全标准规定，食品中副溶血性弧菌的满意标准(Satisfactorystandard)为低于20CFU/g，可接受标准（Acceptablestandard)为20CFU/g〈100CFU/g。荷兰海产品中副溶血性弧菌限量值为100CFU/g。国际食品微生物标准委员会(ICMSF)1998年的标准为:检测副溶血性弧菌时在同一批次产品中应采集检验5份样品各25g，要求不得有3个及以上样品的检验结果在CFU/g之间，任一样品不得超过103CFU/g。。[0005]1989年，Strokes首次提出整合子的概念，1991年Hall正式提出了基因盒一整合子系统的概念。整合子是细菌的DNA片段，与细菌耐药性密切相关，是一种存在于细菌质粒或染色体上的遗传元件系统，通过自身编码的整合酶来获取外源基因并使之表达。整合子捕获、整合和表达耐药性基因盒，引起耐药基因在同种或不同种菌属间传播，从而使细菌的耐药性得以广泛扩散。基因盒通过整合子上整合酶被整合到整合子中或从整合子里被剪切下来，使耐药基因得以传播与扩散。[0006]目前，已有130多种耐药基因盒被确认整合子通过位点特异性重组捕获并表达外源基因盒，从而赋予宿主菌对各种常用药物种类产生耐药性。同时整合子自身可位于接合性质粒、转座子等可移动性元件上，可使整个整合子发生移动。因而整合子在新的耐药菌株的出现及耐药基因水平播散中扮演着非常重要的角色。整合子根据整合酶蛋白的一级结构主要分为4类，但第1类整合子最常见。本发明通过设计针对副溶血性弧菌和整合子的特异引物、探针组合，可了解不同食品中副溶血性弧菌的分布和菌株中整合子的流行情况。[0007]目前，各类食品安全标准都要求对副溶血性弧菌的进行定量检测，但对于副溶血性弧菌的定量检测主要还是通过传统方法进行培养后计数。而常规PCR方法需要PCR扩增后进行电泳，不仅操作繁琐，而且不可能实现定量检测。目前，Southernblot和实时荧光定量PCR是常用的两种外源基因拷贝数分析技术，已广泛用于外源基因拷贝数分析。但这两种方法也存在一定缺陷。例如，Southernblot方法分析时工作量大、周期长、操作要求高、准确性较差，特别是对于多拷贝基因的分析，结果容易偏小。荧光定量PCR(qRT-PCR)在分析外源基因拷贝数时必须依赖于标准曲线和已知拷贝数的基因，只是一种相对定量方法，且标准曲线的质量易受到DNA纯度、引物和探针的浓度、反应抑制因子等诸多因素影响；另外，标准曲线必须基于标准物质建立，而标准物质的种类有限和昂贵价格不能适用于所有的研究。[0008]微滴数字PCR(dropletdigitalPCR，ddPCR)是近年来兴起的一种新的绝对定量技术，它基于单分子PCR方法来进行计数的核酸定量，是一种绝对定量的方法。主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的基因拷贝数。[0009]但基于微滴数字PCR平台的拷贝数的分析工作报道较少，针对副溶血性弧菌及整合子的检测就更未见报道了。本发明基于微滴式ddPCR平台，建立了副溶血性弧菌及其整合子基因拷贝数分析方法，研究结果为分析食品安全生物源性风险因子的定量检测提供了新的方法和借鉴，也为食品安全质量控制提供了一个技术支撑手段。【
发明内容】[0010]本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种用于检测食品中副溶血性弧菌及整合子的引物，以及与该引物配合使用的探针；[0011]本发明另一个目的是提供一种包含上述引物和探针的试剂盒，该试剂盒适用于双重ddPCR检测食品中副溶血性弧菌及整合子，试剂盒中引物、探针以及其它组分、配合合理，使用方便，检测快捷，准确；[0012]本发明另一个目的是提供一种采用上述试剂盒检测食品中副溶血性弧菌及整合子inti的方法，该方法操作简便、快速，成本低，检测结果准确。[0013]为了达到上述目的，本发明采用以下方案：[0014]-种检测食品中副溶血性弧菌和整合子的引物，其特征在于包括副溶血性弧菌引物和整合子引物；[0015]所述副溶血性弧菌引物的序列为：[0016]上游引物VPF:GCCACACTGGAACTGAGACA[0017]下游引物VPR:GGAGTTAGCCGGTGCTTCTT;[0018]所述整合子引物的序列为：[0019]上游引物intIF:CATCGTCGTAGAGACGTCGG[0020]下游引物In11R:AGAACAAGCAGGCATCACGA。[0021]本发明与如上所述引物配合使用的探针，其特征在于包括副溶血性弧菌探针和整合子探针：[0022]所述副溶血性弧菌探针的序列为：[0023]探针VPP:TGCATTATTTGACGTTAGCGAC[0024]所述整合子探针序列为：[0025]探针In11P:AGGGTGTGCGGTGTGGCGGGC。[0026]本发明用于检测食品中副溶血性弧菌和整合子的试剂盒，其特征在于包含权利要求1中的引物和权利要求2中的探针。[0027]如上所述的用于检测食品中副溶血性弧菌和整合子的试剂盒，其特征在于该试剂盒中20.0yL反应体系包括以下组分:2XddPCRSuperMixlO.OyL，副溶血性弧菌和整合子inti的正反向引物各1.0yL、副溶血性弧菌和整合子inti的探针各1.0yL，DNA模板4.OyL。[0028]本发明检测食品中副溶血性弧菌及整合子inti的方法，其特征在于包括以下步骤：[0029]A、提取样品DNA;[0030]将各反应组分加入如权利要求4所述的20.ΟμL反应体系，然后加入70.ΟμL矿物油，混匀后转移到微滴发生器上自动产生微滴；同时分别取试剂盒中的阳性质控和阴性质控，制备相应的DNA模板；[0031]Β、将数字PCR混合液ddPCRSuperMix制作成油包水PCR微反应体系，并全部转移到96孔反应板PCR反应管中；再将96孔反应板PCR反应管在封膜仪上封膜，并置于普通PCR仪进行PCR反应；[0032]C、打开微滴荧光检测器应用软件，将PCR反应结束后的96孔反应板PCR反应管直接插入设备，检测每个96孔反应板PCR反应管中微滴的PCR反应情况，最后根据珀松分布定律算出待测基因的拷贝数。[0033]如上所述检测食品中副溶血性弧菌及整合子inti的方法，其特征在于步骤C中PCR扩增的反应程序按以下步骤进行：[0034](DMcC预变性3min;[0035](2)94°C变性10s，60°C退火lmin，共进行40个循环；[0036](3)98。(：酶热失活IOmin;[0037](4)4Γ停止反应。[0038]如上所述检测食品中副溶血性弧菌及整合子inti的方法，其特征在于步骤A中所述提取样品DNA的具体步骤如下：[0039]取1.5mL培养物1000Orpm离心2min;沉淀物加入500yL的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30yL10%SDS，混匀，于37°C温育Ih;加入IOOyL5mol/LNaCl,充分混匀，再加入80ulCTAB/NaCl溶液，混匀后再65°C温育IOmin;加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min，将上清转入一只新管中，加入0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来;沉淀用ImL的70%乙醇洗涤后，加入TE溶液溶解沉淀。[0040]如上所述检测食品中副溶血性弧菌及整合子inti的方法，其特征在于其特征在于步骤B中取阳性质控、和阴性质控制备相应的DNA模板的方法与步骤A中的方法相同。[0041]本发明中敏感性和特异性试验：[0042]采用测序等方法对阳性扩增产物进行测序验证，结果阳性扩增产物序列进行Blast比较时，序列均与Genbank目的序列高度同源。将10倍稀释的参考菌株基因组DNA加入前述反应体系，重复试验显示检测样品过程中具有很好重复性。稀释模板浓度对数值和拷贝数值之间也呈良好的线性关系R2多0.95。说明该方法具有较好的精确度和良好的稳定性。[0043]本发明与现有技术相比，具有以下优点：[0044]1)本发明试剂盒组分和配比合理，使用方便，检测快捷，准确，适用于ddPCR定量检测副溶血性弧菌及整合子(inti);[0045]2)本发明检测方法简化了检测流程，而且无需制作标准曲线，大大缩短了检测周期，检测时间比传统培养计数方法缩短两天左右；[0046]3)本发明检测方法整个过程无需使用标准曲线，且与新一代测序无缝对接直接，对基因拷贝数可执行绝对定量分析。[0047]4)数字PCR检测系统通过微滴化处理，可以大大减少背景和基质的干扰，灵敏度可以低至1个拷贝，因此，对低浓度基因浓度的细微变化进行准确及重复性佳的检测。[0048]5)采用本发明检测方法在同一反应体系即可实现同时副溶血性弧菌和整合子进行精准检测，操作简便、快速。具有较好的产业化前景。【具体实施方式】[0049]下面结合【具体实施方式】对本发明做进一步描述：[0050]实施例1[0051]本发明检测食品中副溶血性弧菌及整合子(inti)的引物，该引物的序列分别为：[0052]上游引物VPF:GCCACACTGGAACTGAGACA[0053]下游引物VPR:GGAGTTAGCCGGTGCTTCTT[0054]探针VPP:TGCATTATTTGACGTTAGCGAC[0055]上游引物intlF:CATCGTCGTAGAGACGTCGG[0056]下游引物IntlR:AGAACAAGCAGGCATCACGA[0057]探针In11P:AGGGTGTGCGGTGTGGCGGGC。[0058]实施例2[0059]本发明一种检测食品中副溶血性弧菌及整合子inti的试剂盒，其中20yL反应体系包括以下组分：[0060]2XddPCRSuperMix10.0yL，副溶血性弧菌和inti正反向引物各1.0yL、探针各I.OyUDNA模板4.OyL。[0061]其中引物序列如下：[0062]上游引物VPF:GCCACACTGGAACTGAGACA[0063]下游引物VPR:GGAGTTAGCCGGTGCTTCTT[0064]探针VPP:TGCATTATTTGACGTTAGCGAC[0065]上游引物intIF:CATCGTCGTAGAGACGTCGG[0066]下游引物IntlR:AGAACAAGCAGGCATCACGA[0067]探针In11P:AGGGTGTGCGGTGTGGCGGGC。[0068]实施例3[0069]本发明检测食品中副溶血性弧菌及整合子inti的方法，包括以下步骤：[0070]A、提取样品DNA;[0071]将各反应组分加入20.ΟμL反应体系，然后加入70.ΟμL矿物油，混匀后转移到微滴发生器上自动产生微滴；[0072]其中20yL反应体系包括以下组分：[0073]2XddPCRSuperMix10·OyL，副溶血性弧菌和inti正反向引物各1·OyL、探针各I.OyUDNA模板4.OyL。[0074]其中引物序列如下：[0075]上游引物VPF:GCCACACTGGAACTGAGACA[0076]下游引物VPR:GGAGTTAGCCGGTGCTTCTT[0077]探针VPP:TGCATTATTTGACGTTAGCGAC[0078]上游引物intlF:CATCGTCGTAGAGACGTCGG[0079]下游引物In11R:AGAACAAGCAGGCATCACGA[0080]探针In11P:AGGGTGTGCGGTGTGGCGGGC。[0081]B、将产生的微滴仔细全部转移到96孔反应板PCR反应管中；再将96孔反应板在封膜仪上封膜，并置于普通PCR仪进行PCR反应。[0082]C、打开微滴荧光检测器应用软件，将PCR反应结束后的96孔反应板直接插入设备，检测每PCR反应管中微滴的PCR反应情况，最后根据珀松分布定律算出待测基因的拷贝数。[0083]所述的荧光PCR扩增按以下步骤进行：[0084](1)94。(：预变性311^11;[0085](2)94Γ变性1〇8,60。(：退火11^11，共进行40个循环；[0086](3)98。(：酶热失活IOmin;[0087](4)4Γ停止反应。[0088]实施例4[0089]称取Ig前增菌样品，其中可根据样品的DNA含量，调整样品量，加入到50mL的离心管中；加入5mLCTAB提取液和20yL蛋白酶K溶液，充分混匀。65°C孵育30min，不时振荡；吸水性大的食品样品，加入CTAB提取液的量应根据液面是否能盖住样品并多出少许而定;65°C过夜后，8000r/min室温离心10min，取Iml上清液入2ml离心管中；加入700yL氯仿后用力振荡，13000g离心10min，转移上清液600yL到新的2ml离心管中；加入2倍体积的CTAB沉淀溶液颠倒数次后室温静置60min，13000Xg离心10min，弃去上清，加入350yLNaCl溶液将沉淀进行悬浮，再加入350yL氯仿，祸旋振荡进行混勾，13000g离心10min，转移上清后加入0.8倍体积的异丙醇用来沉淀核酸，室温放置20min，13000g离心10min，弃去上清，加入500yL70%乙醇溶液洗涤沉淀，溶解于50yLTE溶液中。然后取4.OyL提取物加入到以下反应体系，[0090]其中2XddPCRSuperMixlO.OyL，副溶血性弧菌和（inti)正反向引物各l.OyL、探针各1.0yL，DNA模板4.OyL。其中引物序列如下：[0091]上游引物I，VPF:GCCACACTGGAACTGAGACA[0092]下游引物I，VPR:GGAGTTAGCCGGTGCTTCTT[0093]探针I，VPP:TGCATTATTTGACGTTAGCGAC[0094]上游引物2，intIF:CATCGTCGTAGAGACGTCGG[0095]下游引物2，IntlR:AGAACAAGCAGGCATCACGA[0096]探针2，IntlP:AGGGTGTGCGGTGTGGCGGGC。[0097]进行PCR扩增，按以下步骤进行：[0098](DMcC预变性3min;[0099](2)94°C变性10s，60°C退火lmin，共进行40个循环；[0100](3)98。(：酶热失活IOmin;[0101](4)4Γ停止反应。[0102]为了证明本发明检测方法的准确性，本发明作了以下对比试验:分别采用本发明检测方法和平板计数法GB4789.7-2013《食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验》进行副溶血性弧菌数量测定的对照。具体的实验操作均按照标准测定数值进行，实验重复三次，结果取平均值。结果如表1所示，从结果可以看出，本发明采用数字PCR方法对食品中大肠菌群数量的测定结果，与现有的GB4789.7-2013相比，10份样，平均误差为1.8%，这说明本发明方法具有很高的准确度。另外，本发明数字PCR尽欢方法的单样本全程检测时间为4小时，远短于现有传统的平板培养计数方法，而且检测副溶血性弧菌的同时，还能对其整合子进行很好的检测，能够准确快速评价食源性致病菌和致病菌携带耐药基因的传播风险。因此具有良好的技术优势和产业化发展前景。[0103]表1[0105]以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。【主权项】1.一种检测食品中副溶血性弧菌和整合子的引物，其特征在于包括副溶血性弧菌引物和整合子引物；所述副溶血性弧菌引物的序列为：上游引物VPF:GCCACACTGGAACTGAGACA下游引物VPR:GGAGTTAGCCGGTGCTTCTT;所述整合子引物的序列为：上游引物intIF:CATCGTCGTAGAGACGTCGG下游引物Int1R:AGAACAAGCAGGCATCACGA。2.与权利要求1所述引物配合使用的探针，其特征在于包括副溶血性弧菌探针和整合子探针：所述副溶血性弧菌探针的序列为：探针VPP:TGCATTATTTGACGTTAGCGAC所述整合子探针序列为探针IntIP:AGGGTGTGCGGTGTGGCGGGC。3.用于检测副溶血性弧菌和整合子的试剂盒，其特征在于包含权利要求1中的引物和权利要求2中的探针。4.根据权利3所述的用于检测副溶血性弧菌和整合子的试剂盒，其特征在于该试剂盒中20.0yL反应体系包括以下组分：2XddPCRSuperMixlO.OyL，副溶血性弧菌和整合子inti的正反向引物各1.OyL、副溶血性弧菌和整合子inti的探针各1.OyL，DNA模板4.OyL。5.检测副溶血性弧菌及整合子int1的方法，其特征在于包括以下步骤：A、提取样品DNA;将各反应组分加入如权利要求4所述的20.ΟμL反应体系，然后加入70.ΟμL矿物油，混匀后转移到微滴发生器上自动产生微滴；同时分别取试剂盒中的阳性质控和阴性质控，制备相应的DNA模板；Β、将数字PCR混合液ddPCRSuperMix制作成油包水PCR微反应体系，并全部转移到96孔反应板PCR反应管中；再将96孔反应板PCR反应管在封膜仪上封膜，并置于普通PCR仪进行PCR反应；C、打开微滴荧光检测器应用软件，将PCR反应结束后的96孔反应板PCR反应管直接插入设备，检测每个96孔反应板PCR反应管中微滴的PCR反应情况，最后根据珀松分布定律算出待测基因的拷贝数。6.根据权利要求5所述检测副溶血性弧菌及整合子inti的方法，其特征在于步骤C中PCR扩增的反应程序按以下步骤进行：(1)94°C预变性3min;(2)94°0变性1〇8,60°(^退火1111；[11，共进行40个循环；(3)98°C酶热失活lOmin;(4)4°C停止反应。7.根据权利要求5所述检测副溶血性弧菌及整合子inti的方法，其特征在于步骤A中所述提取样品DNA的具体步骤如下：取1.5mL培养物lOOOOrpm离心2min;沉淀物加入500yL的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30yL10%SDS，混匀，于37°C温育lh;加入lOOyL5mol/LNaCl，充分混匀，再加入80ulCTAB/NaCl溶液，混匀后再65°C温育lOmin;加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min，将上清转入一只新管中，加入0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来;沉淀用lmL的70%乙醇洗涤后，加入TE溶液溶解沉淀。8.根据权利要求5所述检测副溶血性弧菌及整合子inti的方法，其特征在于其特征在于步骤B中取阳性质控、和阴性质控制备相应的DNA模板的方法与步骤A中的方法相同。【文档编号】C12N15/11GK106086208SQ201610624551【公开日】2016年11月9日【申请日】2016年7月29日公开号201610624551.4,CN106086208A,CN106086208A,CN201610624551,CN-A-106086208,CN106086208A,CN106086208A,CN201610624551,CN201610624551.4【发明人】蔡先全,吴冰,王勇,邱德义,李蓉,邱霞,张杰豪,萧崎倩【申请人】中山出入境检验检疫局检验检疫技术中心