一种副溶血性弧菌的分子检测方法及其应用的制作方法

一种副溶血性弧菌的分子检测方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种副溶血性弧菌的分子检测方法，采用单引物等温扩增方法，以副溶血性弧菌gyrB 基因特异序列为靶序列，SYBER GreenⅡ为荧光染料，实时荧光定量PCR检测扩增信号；本发明还涉及其应用。本发明的检测方法灵敏度高，特异性和敏感性强，对模板DNA要求较低，耗时短，方法简便。
【专利说明】-种副溶血性弧菌的分子检测方法及其应用

【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种副溶血性弧菌的分子检测方法及其应 用。

【背景技术】
[0002] 致病性弧菌仍Kz'fo-io)是一类重要的食源性病原菌，广泛地存在于自 然水环境，特别是海水中，对海产品有较大程度的污染。在弧菌属中，危害较大或出现频率 较高的是01型霍乱弧菌、副溶血性弧菌和创伤弧菌。人食用污染有该菌的海产品后可引起 急性胃肠炎，严重时还可引起败血症。目前，在中国沿海地区的食物中毒病例中，副溶血性 弧菌已成为微生物性食物中毒的首要病原菌。能够快速而准确地从海产食品中将副溶血弧 菌鉴定出来，具有非常重要的医学意义。
[0003] 目前，食品中副溶血性弧菌检验主要依据GB 4789.7-2013, SN/T 0173-2010对食 品中的副溶血性弧菌进行检测，大约需要3?7d的时间，且容易出现交叉污染和假阳性。 分子生物学技术具有快速、直观、准确等优势，已在副溶血性弧菌检测中得到广泛应用。随 着食品安全检测标准的提高，寻找更加快速、准确、便捷的检测技术显得至关重要。
[0004] Ward 等（Ward LN，Be j AK. Detection of Vibrio parahaemolyticus in shellfish by use of multiplexed real-time PCR with TaqMan fluorescent probes[ J] .Applied and Environmental Microbiology，2006，72 :2031-2042 ?)建立基于 TaqMan荧光探针的多重实时PCR方法检测贝类中的VP的tlh、tdh、trh和0RF8基因， 试验结果证明，该方法可用于检测基因组DNA和细菌纯培养物，其灵敏度分别可达200 pg 和 1X104 CFU/mL〇 Wataru 等（Wataru Yamazaki , Yuko umeda, Naoaki Misawa, et al .Development of a Loop-Mediated Isothermal Amp1ifi cation Assay for Sensitive and Rapid Detect ion of the tdh and trh Genes of Vibrio parahaemolyti cus and RelatedVibrio Species [ J] . Applied and environmental microbiology , 2010 , 76:820-828 .)建立的检测副溶血弧菌的tdh和trh基因的LAMP方法检测tdh、trhl和 壮112基因的灵敏度分别可达0.8、21.3、5.0 0?"反应体系。而且该反应体系特异性强，与 20种其他细菌同时检测，无交叉反应。彭帅等(彭帅，石磊.环介导恒温扩增法快速检测海 产品中的副溶血弧菌[J].生物技术通报，2011 (2): 184-186.)采用环介导恒温扩增方法 (LAMP)，针对副溶血弧菌的gyrB基因设计特异引物进行对副溶血弧菌的检测，检测最低限 可达到10 CFU/mL，灵敏度可以达到0. 1 pg副溶血弧菌基因组DNA。
[0005]单引物等温扩增技术（Single primer isothermal amplification，SPIA)是近年 报道的一种新型线性核酸等温扩增技术。该技术具有操作设备简单、高忠实性、高效率和有 效防污染等优点。目前应用较成熟的单引物等温扩增技术均以病毒作为对象，其扩增后的 检测方法为聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用此种方法检出的灵敏度低，易产生沉淀，且结果假阳 性高，尤其不适应于原核微生物的扩增检出。


【发明内容】

[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简单、耗时短、特异性强、灵敏度高且 便于实时监控的副溶血性弧菌的分子检测方法，本发明还提供所述分子检测方法的应用。
[0007] 本发明解决其技术问题采用的技术方案为：一种副溶血性弧菌的分子检测方法， 采用单引物等温扩增方法，以副溶血性弧菌gyrB基因特异序列为靶序列，SYBER GreenII 为荧光染料，实时荧光检测仪检测扩增的实时荧光信号，其具体过程包括如下步骤： (1) 取含副溶血性弧囷的待检样品，提取基因组DNA ; (2) 建立阪崎肠杆菌的实时荧光单引物等温扩增25 y L反应体系： RNA/DNA 组合引物 5.6 iimol/L、Blocker 1.0 iimol/L、10XBst Buffer 2.5iiL、Bst DNA 聚合酶 12U、10 XRNaseH Buffer 2.5 iiL、RNaseH 5U、dNTPs 0.2 mmol/L、MgC12 5.0 mmol/L、RNase Inhibitor 16U、DNA 模板 1 ii L、SYBER GreenII0? L，其余用灭菌 DEPC 水 补足体系； 所述SYBER GreenII为300倍稀释； 将DNA模板、组合引物、Blocker及反应缓冲液的混合液经99°C，90s处理后降温至 60°C，迅速加入RNase H和Bst DNA聚合酶，在实时荧光定量PCR仪上57°C反应40min，反 应过程中实时监测荧光信号； (3) 检测分析：分析检测数据。
[0008] 优选的，所述引物选用GCGUGAA-GGTTTGACTGCC，5'端7nt碱基为RNA序列，3'端 12nt碱基为DNA序列；BlockerCGGCGATGGGTG 3'端用生物素修饰，中间随机加上四个 IXNA修饰。
[0009] 优选的，所述IXNA包括A，C，G，T，U，mC六种城基中的一种。
[0010] 优选的，步骤（1)所述提取DNA方法采用普通热裂解法、蛋白酶K法、饱和酚法或 商业化试剂盒法。
[0011] 最优的，所述提取DNA方法采用商业化试剂盒法。
[0012] 优选的，步骤（2)在实时荧光定量PCR仪上反应为80个循环，每循环30s。
[0013] 本发明还涉及所述的分子检测方法在海产品食品中副溶血性弧菌检测的应用。
[0014] 本发明所述XNA，即LNA，又称"锁核酸"（Locked nucleic acid，LNA)，是一种经过 修饰的类寡核苷酸衍生物，包括A，C，G，T，U，mC六种城基。XNA结构中P-D-呋喃核糖的 2' _0、4' -C位通过缩水作用形成刚性的结构。一般可见于A-DNA或RNA。
[0015] 本发明的发明构思为：在单引物等温扩增技术的基础上加入荧光染料，建立实时 荧光单引物等温扩增方法，可通过实时荧光检测仪对荧光信号进行实时检测，具有操作简 单、耗时短、实时监控等优点。编码促旋酶的gyrB基因是单拷贝的看家基因，在区分和鉴 定细菌近缘种方面，比非蛋白编码基因16S rDNA具有更高的分辨率 本发明的积极效果在于： SPIA技术相对于其它检测方法有明显优势，首先是等温扩增，其反应无需温度循环等 温条件下即可实现扩增反应使反应更方便省时；其次SPIA扩增具有较高的效率，因为在同 一个模板分子上RNase H不需要等前一次合成结束即可进行引物RNA切割，新引物可以不 断结合引发多个合成反应同时进行；然后该方法可以有效防污染，扩增产物污染造成假阳 性的现象是常规核酸扩增技术(如PCR)常常出现的问题，而SPIA能有效防止这种污染，因 为SPIA的DNA扩增产物缺少5'端引物区大部分序列，因此这些产物无法与引物结合进行 扩增反应，从而有效避免了扩增产物污染的可能性；最后SPIA独特的依赖RNaseH的特点， 使其对RNA序列无直接扩增作用，因此可以在存在大量mRNA的情况下特异扩增基因组DNA 序列，可以用于基因量的准确定量。SPIA技术的缺点是其引物合成相对复杂，因为引物为 DNA和RNA组成的混合引物，因此在合成是较常规的单纯DNA或RNA引物合成相对复杂；且 需要碱基修饰，因为blocker需要对碱基修饰以增强其与模板的结合力。
[0016] 本发明在普通SPIA的基础上，采用加入特异性结合单链DNA的荧光染料SYBER Green II，以gyrB基因为祀序列，利用突光仪进行实时监测扩增情况，建立了实时突光 SPIA检测方法。本发明可省去烦琐的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测过程，比PCR技术和普通 SPIA技术省时省力，成为可以替代PCR的核酸扩增新技术。本发明应用实时荧光SPIA检测 副溶血性弧菌，建立了一种更为特异、敏感的分子检测实际样品中副溶血性弧菌的新技术， 其反应时间仅为40min，实时荧光SPIA检测副溶血性弧菌纯培养DNA的灵敏度为8. 2fg/ U L，对副溶血性弧菌菌悬液的检测灵敏度为1. 35X101 CFU/mL ;对鳕鱼模拟样品中副溶血 性弧菌的检出限是16 CFU/g。本发明的实时荧光SPIA检测副溶血性弧菌灵敏度高，特异性 和敏感性强，对模板DNA要求较低，耗时短，方法简便。
[0017] 本发明中，当反应体系中只添加组合引物时，SPIA反应仍然能进行。在一些不需要 特定位点终止的扩增反应中，可以不加任何引起链终止的序列，如扩增较短的核酸序列时，DNA聚合酶到模板末端自然终止。
[0018] 本发明选用XNA，即LNA，又称"锁核酸"（Lockednucleicacid,LNA)，是一种经过 修饰的类寡核苷酸衍生物，这类核酸可以增加引物或探针的融解温度，加强其稳定性。

【专利附图】

【附图说明】
[0019] 图1本发明实施例中选用Pvrn和Blocker时的副溶血弧菌实时荧光SPIA反应结 果；图 1 中 1:Pvrn+Blocker; 2:DEPCH20。
[0020] 图2-5为副溶血性弧菌实时荧光SPIA引物特异性检测结果； 图2中，1: 副溶血性弧菌K/fo-io 2-7: 仓 1J伤弧菌 {//办_/'2'01^/^/'_/<^/5\霍乱弧菌{//77_/'/〇<^〇/6?/' <3(9、拟态弧菌{//77_/'/〇?/?/<^/5\哈维氏斯弧菌Vibrio harveyi、洛齋孤舊Vibrio alginolyticus、%m舊Vibrio anguillarum.'^r. 照（DEPCH20); 图3中，1:副溶血性弧菌Kz'Ario 心; 2-7:福氏志贺氏菌Shi ge 11 a flexneri、单核细胞增生李斯特氏菌Zisteria 、鼠伤寒沙门氏菌 應、大肠杆菌 0157:H7 co/i0757//7、錯样芽胞杆菌 cerews、小肠结肠炎耶儿森氏菌Ifensiflia<9/?teroco7itica;8:DEPCH20; 图4中，1:副溶血性弧菌Kz'Ario 心2_7:大肠埃希氏菌 co7i、金黄色葡萄球菌 aurews、弗氏朽1 樣酸杆菌 CYtroAacter 河生肠杆菌你teroAac ter a備粘质沙雷氏菌5krra tia 、奠肠球菌 Enterococcus faecali5;8:DEPCH20； 图5中，1:副溶血性弧菌K/Ario /7araAa6W〇心2_7:乙型溶血性链球菌Streptococcus hemolytic-J3、蹲轰专墓赛单觀麗Stenotrophomonas maltophilia、塊 衣芽抱杆菌恶臭假单胞菌肺炎克雷伯Klebsiella pneumoniae pneumoniae、奇异变你妖麗Proteus mirabilis; 8: DEPC H20〇 [0021]图6为不同模板DNA提取方法对副溶血性弧菌实时荧光SPIA检测结果的比较；图 6中1:试剂盒法；2:普通热裂解法；3:蛋白酶K法；4:饱和酚提取；5: DEPC H20。
[0022] 图7为副溶血性弧菌实时荧光SPIA检测方法的灵敏性试验结果；图7中，1: Vibrio parahaemolyticus\2-5: 8. 2X 102fg/ u L>8. 2X lO^g/ u L>8. 2X 10°fg/ u L> 8. 2X10_1fg/u L; 6; DEPC H20〇
[0023] 图8为实时荧光SPIA检测模拟样品中副溶血性弧菌的检出限分析结果；图8中， 1:Vibrio parahaemolyticus]2-5: 1.6X103CFU/ gU.6X102CFU/ gU.eXIO'CFU/ g, 1. 6X10°CFU/ g; 6: DEPC H20〇

【具体实施方式】
[0024] 为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面将结合本发明实施 例中的附图和【具体实施方式】，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然， 所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施 例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于 本发明保护的范围。
[0025] 以下实验均由河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心生物实验室完成。
[0026] 1材料和方法 1. 1材料 1. 1. 1试验菌株 本实验所用菌株见表1。
[0027] 表1试验用菌株

【权利要求】
1. 一种副溶血性弧菌的分子检测方法，其特征在于，采用单引物等温扩增方法，以副溶 血性弧菌gyrB基因特异序列为靶序列，SYBER Green II为荧光染料，实时荧光检测仪检测 扩增的实时荧光信号。
2. 根据权利要求1所述的一种副溶血性弧菌的分子检测方法，其特征在于，其具体过 程包括如下步骤： (1) 取含副溶血性弧囷的待检样品，提取基因组DNA ; (2) 建立阪崎肠杆菌的实时荧光单引物等温扩增25 y L反应体系： RNA/DNA 组合引物 5.6 iimol/L、Blocker 1.0 iimol/L、10XBst Buffer 2.5iiL、Bst DNA 聚合酶 12U、10 XRNaseH Buffer 2.5 iiL、RNaseH 5U、dNTPs 0.2 mmol/L、MgCl2 5.0 mmol/L、RNase Inhibitor 16U、DNA 模板 1 ii L、SYBER Green II 0? L，其余用灭菌 DEPC 水 补足体系； 所述SYBER Green II为300倍稀释； 将DNA模板、组合引物、Blocker及反应缓冲液的混合液经99°C，90s处理后降温至 60°C，迅速加入RNase H和Bst DNA聚合酶，在实时荧光定量PCR仪上57°C反应40min，反 应过程中实时监测荧光信号； (3) 检测分析：分析检测数据。
3. 根据权利要求2所述的一种副溶血性弧菌的分子检测方法，其特征在于，所述引 物选用GCGUGAA-GGTTTGACTGCC，5'端7nt碱基为RNA序列，3'端12nt碱基为DNA序列； Blocker选用CGGCGATGGGTG，3'端用生物素修饰，中间随机加上四个IXNA修饰。
4. 根据权利要求3所述的一种副溶血性弧菌的分子检测方法，其特征在于，所述IXNA 包括A，C，G，T，U，mC六种城基中的一种。
5. 根据权利要求2所述的一种副溶血性弧菌的分子检测方法，其特征在于，步骤（1)所 述提取DNA方法采用普通热裂解法、蛋白酶K法、饱和酚法或商业化试剂盒法。
6. 根据权利要求5所述的一种副溶血性弧菌的分子检测方法，其特征在于，所述提取 DNA方法采用商业化试剂盒法。
7. 根据权利要求2所述的一种副溶血性弧菌的分子检测方法，其特征在于，步骤（2)在 实时荧光定量PCR仪上反应为80个循环，每循环30s。
8. -种权利要求1-7任一项所述的分子检测方法在海产品食品中副溶血性弧菌检测 的应用。
【文档编号】C12R1/63GK104450930SQ201410803758
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月23日 优先权日:2014年12月23日
【发明者】王建昌, 段永生, 李静, 孙晓霞, 胡连霞 申请人:河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心