专利名称：霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌的三重pcr检测方法
技术领域：
本发明属于环境科学水体病原菌检测领域，是应用三重聚合酶链式反应(全称Polymerase Chain Reaction,简称PCR)技术，将被测病原菌微量的目的基因片段体外扩增，快速检测水样中的霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌，评价并预警海洋环境这三种致病菌的含量及污染情况。
背景技术：
霍乱弧菌(VibrioCholerae)、副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus)和创伤弧菌(Vibrio Vulnificus)是三种常见的革兰氏阴性弧菌，在海洋环境中广泛分布。人们主要通过食用被污染的海产品感染以上三种病原菌，也可能通过伤口接触污染的海水、礁石等而感染，会在短时间内引起患者腹痛腹泻、呕吐，甚至内脏淤血和败血症。在美国、丹麦、西班牙、以色列及我国台湾等一些沿海城市，都有过副溶血弧菌和创伤弧菌感染的临床报告，大多因多器官功能障碍而死亡。历史上曾有过6次霍乱世界性大流行，无一不祸及中国。三种病原菌都能通过粪口途径在人群中传播，威胁人类的生命健康安全。PCR技术是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，三重PCR方法是多重PCR方法的一个分支。与传统的生物学方法相比，PCR技术具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时省力等优点。近二十几年来，该技术已经成为最常用、也是最重要的分子生物学技术之一。三重PCR在单一 PCR基础上，向同一反应体系中加入三对引物，同时扩增出三段DNA片段，这样更加节省了时间和成本。建立三重PCR方法用于快速检测样品中的病原微生物具有重要的实际意义和应用价值，因而越来越受到人们的关注。
发明内容
本发明根据霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌的保守序列，分别选择退火温度相同的引物，并使三种不同细菌的目的基因片段长度不等。提取三种细菌的DNA基因组，在同一体系中同时进行三重PCR扩增反应。扩增结果通过琼脂糖凝胶电泳观察，整个检测时间只需6_8小时。本发明是通过以下技术方案实现的:1、DNA模板的准备将三种细菌的菌种分别接种到已灭菌的LB液体培养基中，振荡18小时(创伤弧菌于28°C，霍乱弧菌和副溶血弧菌于37°C )，所得的菌液用已过滤的无菌海水稀释一定的倍数，用试剂盒提取两种细菌的基因组DNA。2、用于三重PCR的三对引物核苷酸序列如下:
权利要求
1.霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌三重PCR检测方法的特征在于将三种病原菌的特异性引物加入到同一反应体系中。本发明是通过以下技术方案实现的: 1)DNA模板的准备 将三种细菌的菌种分别接种到已灭菌的LB液体培养基中，振荡18小时(创伤弧菌于28°C，霍乱弧菌和副溶血弧菌于37°C )，所得的菌液用已过滤的无菌海水稀释一定的倍数，用试剂盒提取两种细菌的基因组DNA。
2)设计三重PCR的三对引物，核苷酸序列如下:
2.权利要求I所述的三重PCR反应方法检测样品中的霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌，可用于检测海水样品以及其他水样中的霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌。
全文摘要
本发明属于环境科学水体病原菌检测领域，通过基因片段的体外酶促扩增，快速检测水样中的霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌，评价并预警海洋环境这三种致病菌的含量及污染情况。霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌是三种常见的革兰氏阴性弧菌，在海洋环境中广泛分布，能感染人类，通过粪口途径在人群中传播。PCR技术具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时省力等优点。三重PCR在单一PCR基础上，向同一反应体系中加入三对引物，同时扩增出三段DNA片段，这样更加节省了时间和成本。建立三重PCR方法用于快速检测样品中的病原微生物具有重要的实际意义和应用价值，因而越来越受到人们的关注。
文档编号C12Q1/68GK103255202SQ20121003769
公开日2013年8月21日 申请日期2012年2月20日 优先权日2012年2月20日
发明者王林同, 朱琳, 明红霞, 王轲 申请人:南开大学