一种致病哈氏弧菌特异性分子遗传标记及其应用
【专利摘要】本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种致病哈氏弧菌特异性分子遗传标记及其应用。具体为所述致病哈氏弧菌遗传标记具有序列表SEQ ID No.1中的碱基序列，其应用为利用遗传标记可特异性的检测致病哈氏弧菌。本发明基于该标记可快速、准确检测致病哈氏弧菌，应用范围广泛，并且简单易行，无需细菌培养、DNA提取等步骤。
【专利说明】
一种致病哈氏弧菌特异性分子遗传标记及其应用
技术领域
[0001]本发明涉及分子生物学领域，尤其是一种致病哈氏弧菌特异性分子遗传标记及其应用。
【背景技术】
[0002]哈氏弧菌(Vibr1 harveyi)广泛分布于海水环境中，是海水养殖动物最重要的细菌性病原之一，能够感染脊椎与非脊椎动物，包括鱼、虾、贝、螺、海参等。同其它感染一样，致病哈氏弧菌感染的早期诊断将有利于疾病的防控。然而，同霍乱弧菌、副溶血弧菌和鳗弧菌等重要水产传染性病原一样，即同一种弧菌中只有少数分子流行病学特征的毒力菌株能导致暴发性流行病的发生，而绝大多数菌株为非毒力菌株，且不具致病性致病，哈维氏弧菌不同菌株之间的毒力相差甚远，许多菌株为海洋环境(包括海洋动物体内环境)的正常菌株;而有些菌株则是海水养殖动物的常见病原，对全球海水养殖鱼类、虾蟹类和贝类都造成了十分严重的危害。目前，已有几种利用分子生物学手段检测哈氏弧菌的方法，包括通过PCR分析溶血素基因vhh、调控蛋白基因toxR、促旋酶基因gyrB、vhhP2基因以及16S rRNA基因。由于这些基因皆不能区分有毒株和无毒株，无法准确诊断哈氏弧菌疾病，且有些方法需要细菌培养及DNA提取，在操作上有一定的时间要求和技术要求。
【发明内容】
[0003]本发明目的在于提供一种致病哈氏弧菌特异性分子遗传标记及其应用。
[0004]本发明采用的技术方案为:
致病哈氏弧菌特异性分子遗传标记:序列表SEQ ID N0.1中的碱基序列。
[0005]特异性分子遗传标记的应用:所述遗传标记可特异性的检测致病哈氏弧菌。
[0006]1、根据序列表SEQ ID N0.1中的碱基序列所示的致病哈氏弧菌特异性分子遗传标记，涉及的引物为:引物3858P1F(5 ’ -TACATCTACCATTTCCGTAAACA-3，)和3858P1R(5 ’ -ATTGAGGTAAAAGTTTCAGCACATC-3’)。
[0007]、待测鱼组织样品的制备:于无菌条件下取鱼脑、肝脏、脾脏、肾脏，将脑、肝脏、脾脏、肾脏加入Iml无菌生理盐水进行匀浆，而后进行稀释，待用。
[0008]、环境样品的制备:自环境中取20ml水体，用孔径为80?120μπι快速定量分析滤纸过滤，除去大颗粒杂质，滤液经12000rpm离心1min，去掉上清，沉淀用ΙΟΟμΙ无菌水重悬，于沸水中煮沸5 min。
[0009]、取ΙΟμΜ的3858P1F和3858P1R为引物，以2μ1步骤2或3中的样品为模板，进行PCR扩增，若得到656 bp PCR产物，即可确定待测鱼组织样品被致病哈氏弧菌感染。
[0010]所述步骤2的组织匀浆液用无菌水进行10 X稀释，而后将稀释液于沸水中煮沸5min。所述步骤3的沉淀用0.5ml无菌水重悬。所述步骤4的PCR反应体系为20μ1 ;PCR过程为:94°〇51^11预变性模板0嫩，然后941€458，601€458，72°(:11^11，20-25个循环后再在72°(:延伸反应1min0
[0011]本发明具有如下优点:
1、准确性较高，本发明所用的遗传标记存在于致病哈氏弧菌中而且具有一定的属内保守性，因而与其它弧菌交叉反应的可能性很小；
2、快速简单。本发明的致病哈氏弧菌检测方法实施过程简单，毋需细菌培养、DNA提取等步骤，只需常规的PCR，2?3小时即可获得结果；
3、应用范围广，本发明的检测方法对样品无特殊要求，可以检测环境及生物源性样品；
4、本发明通过致病哈氏弧菌基因特异分子标记片段385-8，该片段存在于致病哈氏弧菌中，但不存在于非致病哈氏弧菌及其它弧菌中，包括与哈氏弧菌进化关系非常近的溶藻弧菌、副溶血弧菌中，因而该基因片段是一种特异的致病哈氏弧菌遗传标记，用其作为PCR探针可以准确、快速地从多种生物和环境样品中检测致病哈氏弧菌。
【附图说明】
[0012]图1为本发明从鱼组织中检测致病哈氏弧菌的电泳图谱(其中泳道M:DNA markerDL2000;泳道1、2、3、4分别为以注射过⑶H11385的石斑鱼脑、肝脏、脾脏、肾脏为模板所得的PCR产物;泳道5为阳性对照;泳道6、7为阴性对照，分别为以注射过PBS的肝脏、肾脏为模板所得的PCR产物)。
[0013]图2为海水体中检测致病哈氏弧菌的电泳图谱(其中泳道M:DNA marker DL2000；泳道T为添加干扰菌和阳性菌GDHl 1385海水样，泳道C为只添加干扰菌未添加阳性菌海水样)。
【具体实施方式】
[0014]本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法:
1、质粒提取、DNA(PCR)产物纯化皆使用“宝生物工程(大连)有限公司”的相应试剂盒；
2、PCR反应各种组分皆购于“宝生物工程(大连)有限公司”；
实施例1
致病哈氏弧菌特异性分子遗传标记由序列表SEQ ID N0.1中的385-8碱基序列组成。
[0015]序列表SEQID N0.1为: TACATCTACCATTTCCGTAAACATGAAGTTGAACACCGACCCGAATGCGGCGCTGTCTGACATTCTGGCAAAA
ACCAACTCCGTTCGCTCACAACTTCCAAAAGAAGCGGAAGACCCAACAGTAACGATGTCGACTGGCTCGACTACCGCGGTACTGTACATCGGTTTCACCAGTGACGAGTTGTCTTCTAGCCAGATCACCGACTATCTTGAGCGTGTAATCAACCCGCTGCTATTTACGGTAAATGGTGTATCGAAAGTTGACCTATACGGTGGTATGAAATACGCGCTACGCGTATGGCTAGATCCAGCGAAAATGGGCGCACTTAAGCTGACAGCAACCGACGTGATGACGGTACTAAACGCCAACAACTATCAGTCGGCAACCGGTCAGGCGACAGGTGAATTCGTACTTTACAACGGTAGCGCAGATACTCAAGTATCCAACGTTGCTGAACTCGAAGCGCTGGTTGTTAAAACTGGTGAAGGTGACGTCATTCGTCTTGGCGACATTGCGAAAGTGACCTTAGAGAAGAGCCACGACGTTTACCGCGCAAGTGCGAACGGTCAAGAGGCTGTAGTTGCAGCGATCAACGCGGCACCAAGTGCTAACCCAATCAACATCGCGGCAGATGTGCTGAAACTTTTACCTCAAT(a)序列特征:
长度:656bp 类型:碱基序列链型:单链拓扑结构:线性
(b)分子类型:双链DNA
(c)假设:否 ⑷反义:否
(e)最初来源:哈氏弧菌GDHl1385
(f)特异性名称:3858P1
致病哈氏弧菌特异性分子遗传标记的应用，其遗传标记可特异性的检测致病哈氏弧菌。
[0016]鱼组织中致病哈氏弧菌的检测:
1)石斑鱼的人工感染
在液体2216E培养基中培养哈氏弧菌⑶Hl 1385 (保存于海南省热带水生生物技术重点实验室菌种保藏中心，保藏编号为:PBVH33111),30 °C,振荡培养至OD6qq为0.6，4 °C，8000g离心5min，收集菌体，将其悬浮于生理盐水中至终浓度为I X 16 cfy/ml。将10尾石斑鱼(体重15?20g/尾)随机分为2组，每组5尾，一组为实验组(T组)，腹腔注射上述哈氏弧菌悬浮液(ΙΟΟμΙ/尾)，另一组为对照组(C组)，每尾鱼分别腹腔注射ΙΟΟμΙ生理盐水。
[0017]其中2216Ε液体培养基组成成分按重量百分比计:0.5 %蛋白胨，0.1 %酵母膏，
0.01%，3%似(:1，96.4%!120，调？!1值至7.4;生理盐水组成成分按重量百分比计:0.85%NaCl；
2)石斑鱼组织样品制备
在上述步骤I)石斑鱼感染48 h后，于无菌条件下取鱼脑、肝脏、脾脏、肾脏，置于玻璃匀浆器中，加入Iml生理盐水进行匀浆。将组织匀浆液用无菌水进行10X稀释。将稀释液于于沸水中煮沸5 min。
[0018]3)PCR 检测
在0.2ml PCR管中，加入下列成分:2μ1上述步骤2)高温处理后的组织浆液稀释液，浓度 ΙΟμΜ 弓I 物3858P1F (5’-TACATCTACCATTTCCGTAAACA-3 ’)和3858ΡI R(5 ’-ATTGAGGTAAAAGTTTCAGCACATC-3，)各Ιμ?， 2μ1 10XPCR buffer [200mM Tris-NCl(pH
8.4)，200mM KCl，15mM MgCl2],2μ1 1mM dNTPs(各 2.5 mmol/L)，0.25μ1 Taq DNA 聚合酶，加水至总体积为20μ1。
[0019]其中引物3858P1F和3858P1R为致病哈氏弧菌片段385-8特异性引物，其PCR产物大小为656bp。
[0020]按下列条件进行PCR:94°C5min 预变性模板 DNA，然后 94°C45s，60°C45s，72°Clmin，20-25个循环后再在72°C延伸反应lOmin。取5μ1 PCR产物于I %琼脂糖凝胶电泳观察。结果表明(见附图1)，只有用注射哈氏弧菌的石斑鱼组织匀浆液做模版的PCR扩增出一条656bp的阳性条带，而用注射生理盐水的石斑鱼组织匀浆液做模版的PCR则无任何条带。
[0021]实施例2
水体中致病哈氏弧菌的检测 I)水样制备准备两份灭菌海水(命名为C和T)，分别取20ml水体，C海水液加入终浓度为分别为14cfu/ml的无毒哈氏弧菌，溶藻弧菌V.alginolyticus ATCC 33787，副溶血弧菌V.parahemolyticus ATCC17802，拟态弧菌V.mimicus ATCC 33653，弗氏弧菌V.furnissiiATCC 33813和需钠弧菌V.natriegens ATCC 33788，T海水液除加入上述细菌外，再加入终浓度为14 cfu/ml的致病哈氏弧菌⑶Hl 1385。C、T海水液分别用孔径为80?120μπι快速定量分析滤纸过滤，除去大颗粒杂质，滤液经12000rpm离心1min，去掉上清，沉淀用0.1ml无菌水中重悬，于沸水中煮沸5 min。
[0022]2)PCR 检测
在0.2ml PCR管中，加入下列成分:2μ1上述步骤I)高温处理过的C或T重悬液，浓度10μM弓I 物3858P1F (5’-TACATCTACCATTTCCGTAAACA-3’WP3858PlR(5’-ATTGAGGTAAAAGTTTCAGCACATC-3，)各Ιμ?， 2μ1 10XPCR buffer [200mM Tris-NCl(pH
8.4)，200mM KCl，15mM MgCl2],2μ1 1mM dNTPs(各 2.5 mmol/L)，0.25μ1 Taq DNA 聚合酶，加水至总体积为20μ1。
[0023]PCR反应条件同实施例1步骤3)。结果表明(见附图2)，只有添加了致病哈氏弧菌的⑶Hl 1385的T组海水样扩增出一条656bp的阳性条带，C组海水样无任何PCR条带，说明T组水样含有致病哈氏弧菌，C组水样不含有致病哈氏弧菌。
[0024]以上结果表明，本发明的致病性哈氏弧菌检测方法可以快速准确地检测组织以及海水样品中的致病哈氏弧菌。
【主权项】
1.一种致病哈氏弧菌特异性分子遗传标记，其特征在于:致病哈氏弧菌特异性分子遗传标记为序列表SEQ ID N0.1中的碱基序列所示。2.如权利要求1所述的致病哈氏弧菌特异性分子遗传标记的应用，其特征在于:所述遗传标记可特异性的检测致病哈氏弧菌。3.如权利要求2所述的致病哈氏弧菌特异性分子遗传标记的应用，其特征在于: (1)、根据序列表SEQID N0.1中的碱基序列所示的致病哈氏弧菌特异性分子遗传标记，涉及的引物为:引物3858P1F(5 ’ -TACATCTACCATTTCCGTAAACA-3，)和3858P1R(5 ’ -ATTGAGGTAAAAGTTTCAGCACATC-3’)； (2)、待测组织样品的制备:于无菌条件下取鱼脑、肝脏、脾脏、肾脏，将脑、肝脏、脾脏和肾脏加入Iml无菌生理盐水进行匀浆，而后进行稀释，待用； (3)、环境样品的制备:自环境中取20ml水体，用孔径为80?120μπι快速定量分析滤纸过滤，除去大颗粒杂质，滤液经12000rpm离心1min，去掉上清，沉淀用ΙΟΟμΙ无菌水重悬，于沸水中煮沸5 min； (4)、取ΙΟμΜ的3858P1F和3858P1R为引物，以2μ1步骤(2)或(3)中的样品为模板，进行PCR扩增，若得到656bp PCR产物，即可确定待测鱼组织样品及海水样品被哈氏弧菌感染。4.如权利要求3所述的致病哈氏弧菌特异性分子遗传标记的应用，其特征在于:所述步骤(2)的组织匀浆液用无菌水进行1X稀释，而后将稀释液于沸水中煮沸5 min。5.如权利要求3所述的致病性哈氏弧菌特异性分子遗传标记的应用，其特征在于:所述步骤(3)的沉淀用0.1ml无菌水重悬。6.如权利要求3所述的致病哈氏弧菌特异性分子遗传标记的应用，其特征在于:所述步骤(4)的PCR反应体系为20yl;PCR过程为:94°C5min预变性模板DNA，然后94°C45s，60°C45s，72°C Imin，20-25个循环后再在72°C延伸反应lOmin。
【文档编号】C12Q1/04GK105838803SQ201610310289
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月12日
【发明人】徐先栋, 周永灿, 谢珍玉, 王世锋, 蔡岩, 刘开放
【申请人】海南大学