专利名称：霍乱弧菌口服活菌苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种霍乱工程菌复合苗的制备和应用。
霍乱是由定居在小肠的非侵袭性霍乱弧菌引起的烈性肠道传染病，传播快、波及面广、危害严重。自1883年Koch分离到霍乱病原菌——霍乱弧菌以来，人们就开始了霍乱免疫预防的研究，至今已百余年，尚无理想的霍乱菌苗问世。全细胞死菌苗的保护率仅约为50％，保护持续时间短(约半年)且要多次口服，至今未被世界卫生组织认可。早期人们筛选的天然减毒株和化学方法诱变的减毒株，或因免疫效力低下，或因突变位点不明、理论上可发生回复突变以及由于毒素基因的缺失而无抗毒保护等缺陷未被接受。
随着分子生物学技术的发展，近年来各国学者采用基因重组技术，相继研制了多种菌苗候选株，归纳起来主要有两大类。一类是加法苗，但遗憾的是此类菌苗由于尚无合适的肠道受体菌，从而不能产生有效的保护；第二类是减法苗，在这一类中最为突出的例子是美国菌苗发展中心(CVD)研制的CVD系列菌苗株；但到目前为止，所构建的此类菌苗仍有部分残留毒性，使其应用受到一定限制。以抗生素抗性为选择压力的基因表达系统存在着(1)．质粒的稳定性依赖于抗生素选择性压力的持续存在；(2)．含抗生素抗性质粒的菌苗用于人或动物，有可能造成抗性的扩散，给临床治疗带来困难等缺陷。另外，将外源基因整合到宿主菌染色体上，在体外可以稳定地保留并表达外源基因，虽然可解决和避免以抗生素抗性作为稳定因子的质粒稳定性问题，但该系统基因的表达水平明显低于以质粒作为载体的克隆子，其刺激机体免疫应答的能力也明显低于后者。至今，还无一种商品化的霍乱菌苗问世。
霍乱的免疫特征为以抗菌免疫为主，抗菌与抗毒免疫协同作用，刺激肠道局部产生分泌性IgA抗体。早在六十年代，人们就认识到CT(霍乱肠毒素)是霍乱弧菌致泻的主要毒力因素。CT是一种活性多聚体蛋白，由有腺苷酸转移酶活性的A亚单位及5个相同的与肠上皮细胞上的神经节苷脂受体GM1结合的B亚单位非共价结合而成。CT的毒性作用与免疫原性在构建霍乱菌苗时是相互矛盾的两个方面，意大利Biocine公司应用蛋白质工程技术，通过寡核苷酸介导的定位突变，将ctx基因的第63位丝氨酸突变成赖氨酸，使CT蛋白构象改变，而变为无毒的霍乱肠毒素(CT*)，但仍可表达并分泌完整的CT*毒素蛋白，并可与GM1受体及抗A和抗B亚单位的单抗结合。IEM101是本室筛选出的一株无毒的ctx(霍乱肠毒素基因)基因天然缺失的EVC(埃尔托霍乱弧菌)菌株，动物实验有较好的保护力，人体志愿者一次口服免疫，在人体可定居4-9天，并能刺激机体产生血清和肠道局部特异性保护抗体，无明显毒副作用，为理想的菌苗候选株。但该菌株由于缺少ctx基因，免疫机体后只产生抗菌免疫，不产生抗毒免疫。
本发明的目的是首先选育出霍乱弧菌IEM101菌株的thyA(胸苷酸合成酶基因)基因缺陷受体菌株，进而应用以thyA基因为选择压力的染色体——质粒致死平衡系统，将无毒的CT*毒素基因ctx*(含有点突变的霍乱肠毒素基因)和ct-B(霍乱肠毒素B亚单位基因)基因分别引入，构建成能表达CT*或CT-B(霍乱肠毒素B亚单位)的霍乱弧菌抗菌抗毒口服活菌苗，并通过家兔主动保护试验评价它们的免疫原性及主动保护力，为霍乱病的防治提供口服活菌苗候选株。本发明的菌株已于1998年12月16日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC NO.0377.1和CGMCC NO.0377.2。
本发明的内容与要点本发明包括霍乱弧菌菌株、其生产方法及其使用方法。所说的霍乱弧菌菌株不仅可用作廉价表达系统，批量生产多肽、蛋白质、细胞因子等生物活性物质，还可用作口服活菌苗菌株。
一．thyA基因缺陷的霍乱弧菌IEM101菌株的选育。菌苗的起始材料是天然无毒的O1群霍乱弧菌IEM101菌株(中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所保存)。本发明在改良MM基本培养基的基础上，选育出一株生长良好且生物学性状稳定的霍乱弧菌IEM101菌株的thyA基因缺陷株PL102，作为下一步实验的受体菌株。
二．霍乱弧菌以thyA基因为选择压力的染色体——质粒致死平衡系统的构建(图4)。本发明用PCR(聚合酶链反应)扩增大肠杆菌的thyA基因，PCR产物经地高辛标记后作为探针与IEM101的染色体DNA进行同源性分析，进而将该PCR产物克隆到质粒载体pUC18上，再转化到PL102菌株中，获得含有pXXB106质粒的转化子，并进行质粒稳定性试验。
三．霍乱弧菌抗菌抗毒口服活菌苗的构建(图8、10)。质粒CT-K63经限制性内切酶切后，回收携带有ctx*基因的目的片段，平端连入pUC18载体，再将大肠杆菌的thyA基因连入该重组质粒后，经限制性内切酶切去部分Ap(氨苄青霉素)基因片段，导入PL102中构建成含全ctx*基因的菌苗候选株。根据已报道的ctx基因序列设计一对引物扩增ct-B基因，将PCR产物克隆到pUC18载体上，再将大肠杆菌的thyA基因连入该重组质粒后，经限制性内切酶切去除部分Ap基因片段，导入PL102中，构建成仅含ct-B基因的菌苗候选株。
四．本发明中菌株的特征1．IEM104和IEM105的生物学性状(1)血清型霍乱弧菌EVC小川型。
(2)生化反应发酵葡萄糖、蔗糖、半乳糖、麦芽糖、左旋糖、甘露醇、甘露糖、糊精和可溶性淀粉，产酸不产气；不发酵木胶糖、水杨素、肌醇、卫茅醇、阿拉伯糖；溶血试验阳性。
(3)噬菌体-生物型1a.2．GM-ELISA检测ctx*和ct-B基因的表达无论是培养上清液还是细胞裂解物，均以20倍浓缩后测定CT*或CT-B的表达和分泌。阳性对照为霍乱弧菌高产毒株569B的20倍浓缩液，阴性对照为大肠杆菌DH5α的20倍浓缩细胞裂解物。P/N≥2.0为阳性。
表1CT*和CT-B表达的GM1-ELISA检测
注诱导为在培养物中加入IPTG诱导重组子中目的基因的表达。
569B为阳性对照，DH5α为阴性对照。
P/N≥2.0为阳性，P/N＜2.0为阴性。3．毒力测定家兔小肠结扎测毒将IEM104和IEM105菌分别接种于5ml产毒培养基中，37℃静止培养48小时后，离心收集菌沉淀，用生理盐水稀释到108CFU，取1ml肠内注射，结果IEM104和IEM105的肠段积液量均为0ml/cm(大于1.0ml/cm为阳性)。4．IEM104和IEM105在家兔的免疫原性检测IEM101、IEM104和IEM105分别免疫家兔后不同时期检测PBL(外周血淋巴细胞)分泌抗CT-IgG、血清抗CT-IgG、血清杀弧菌抗体滴度和血清凝集抗体滴度，结果见表2、3、4、5。
表2免疫后不同时期PBL分泌抗CT-IgG ELISA检测结果
注以上数值为各组P/N平均值，P/N≥2.0为阳性，P/N＜2.0为阴性。表3免疫后不同时期血清抗CT-IgG ELISA检测结果
注以上数值为各组P/N平均值，P/N≥2.0为阳性，P/N＜2.0为阴性。表4免疫后不同时期血清杀弧菌抗体滴度
注表中数值为各组抗体滴度的平均值(1)<p>实施例8
实施例9
实施例10
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IEM101、IEM104和IEM105经家兔肠道免疫28天后，用EVC吴江-2(稻叶)，滨-43(小川)和CVC(古典型霍乱弧菌)1119(稻叶)、395(小川)及不同剂量的纯CT毒素攻击。结果见表6。
本发明在构建霍乱菌苗候选株的过程中应用的以非抗生素抗性thyA基因为选择压力的染色体——质粒致死平衡系统，是以细菌的管家基因缺陷菌株作为受体菌，在质粒上克隆入完整的受体菌缺陷的基因，作为外源基因表达载体稳定的选择性压力。该系统较好地解决了质粒稳定性和以抗生素抗性作为选择压力的问题，并能高效表达外源基因。同时由于thyA基因缺失突变株本身是减毒的，带有thyA基因的质粒的丢失并不会增加宿主的毒性，因而该系统是安全的。再者，由于霍乱弧菌本身具有良好的分泌性，在该菌中表达的基因产物可较好地分泌至胞外，利于表达产物的分离与纯化。因此该系统在霍乱弧菌中的应用，提供了一种大量生产外源基因产物的良好体系。
本发明的霍乱弧菌菌株含有全ctx*或ct-B基因，除具有出发菌株IEM101的一切特性外，还具有它们各自携带的外源基因的特征，均能刺激机体产生抗菌与抗毒免疫，且免疫后的家兔能抵抗至少2μg纯CT毒素的攻击，以及较出发菌株IEM101高剂量的野生霍乱弧菌毒株的攻击。
实施例1．将生长于LB培养基上的霍乱弧菌IEM101菌株转种、活化，涂于MM选择培养基上(配方为MM改良培养基，TMP终浓度15μg/ml，胸腺嘧啶核苷终浓度50μg/ml),37℃静止培养18-24小时，挑取生长良好的抗TMP单菌落若干，接种MM选择培养基、含胸腺嘧啶核苷MM改良培养基及MM改良培养基(配方为MM培养基，0.5％酪蛋白水解物，0.3％无水亚硫酸钠，1％柠檬酸钠，1％蔗糖)，在前两种培养基上thyA基因缺陷菌株生长良好，菌落形态与野生菌株一致，而在后一种培养基上霍乱弧菌thyA基因缺陷株不生长。我们把霍乱弧菌IEM101菌株的thyA基因缺陷株命名为PL102。
实施例2．PL102菌株分别在LB、MM改良培养基和含50μg/ml胸腺嘧啶核苷的MM改良液体培养基中连续传代，每10代取各培养物适量涂于MM改良培养基上，观察发生回复突变的情况。结果传至100代，共集菌10次，均未发现有回复突变株出现，故可认为PL102无论是在胸腺嘧啶核苷丰富还是贫乏的环境下，均能保持突变性状稳定。
实施例3．根据已报道的大肠杆菌thyA基因序列设计了一对引物，它们的序列如下P1:5’-CCT GAG CTC CTG ATT GGT TAC GGC G-3’P2:5’-GCA GGT ACC CCA GTT TCT ATT TCT TCG-3’为便于克隆，在P1的5’端加有SacⅠ酶切位点。
按以下参数预变性94℃4分钟；后续循环94℃1分钟，57℃1分钟，72℃1分钟末轮循环72℃7分钟扩增，得到1.13Kb的PCR产物(图1)。
实施例4．大肠杆菌thyA基因PCR产物纯化后按地高辛标记试剂盒说明书进行标记，并按文献常规打点杂交，在68℃、53℃和42℃分别与霍乱弧菌IEM101的染色体DNA进行同源性分析(图2)。在这三种温度条件下均没有特异的杂交出现，表明两者基因的同源性很低，这样它们在体内发生同源重组的机率大为降低，平衡系统也更为稳定。
实施例5．PCR扩增大肠杆菌thyA基因产物用Klenow酶补平后再用SacⅠ酶切，载体pUC18用SacⅠ-SmaⅠ双酶切后，连接两片段，重组质粒命名为pXXB106(图3、4)。将pXXB106电击转化霍乱弧菌(电击缓冲液为272mmol/L蔗糖，7mmol/L Hepes,pH7.3,1mmol/L氯化镁，15％丙三醇，电击参数为2.5KV,25μF,4.8mS，外接600Ω电阻)，得到PL103菌株。
实施例6．重组株质粒稳定性实验在MM改良培养基、含50μg/ml胸腺嘧啶核苷的MM改良培养基和LB培养基中，传代含pXXB106质粒的PL103菌株，各传100代，每10代取各培养物适量，涂于含50μg/ml胸腺嘧啶核苷的MM改良培养基平板上，37℃过夜培养后，随机挑取100株点种于MM改良培养基，计算每100株菌中质粒丢失率，并提取质粒证实。实验表明，PL103在MM改良培养基和LB培养基中是较稳定的，最小稳定性也在95％以上，而在含50μg/ml胸腺嘧啶核苷的MM改良培养基中传至50代时，仅有12％的菌株尚含有质粒，即在胸腺嘧啶核苷丰富(50μg/ml)的培养基中，PL103的稳定性仅为12％(图5)。
实施例7．用HaeⅢ酶切质粒CT-K63，以ctxA标记的探针作Southern blot杂交分析，表明ctx*基因在2Kb片段中(图6)，回收该片段平端连入经HincⅡ酶切的pUC18载体上，该重组质粒用PstⅠ酶切后补平，将大肠杆菌thyA基因平端连入，再用PvuⅠ酶切去除部分Ap基因后自连，电击转入PL102中，获得含pXXB110质粒(图7、8)的转化子，即霍乱弧菌菌苗候选株IEM105。
实施例8．根据已报道的ctx基因序列设计了一对仅扩增ct-B基因的引物序列P3:5’-AAG GAT GAA TTC ATG ATT AAA-3’P4:5’-GCA GAT CTT TAA TTT GCC ATA C-3’PCR产物经EcoRⅠ酶切后连入EcoRⅠ-SmaⅠ酶切的pUC18载体上，再将大肠杆菌thyA基因平端连入该重组质粒的BglⅡ酶切后补平的位点上，用PvuⅠ酶切去除部分Ap基因后自连，获得含质粒pXXB111(图9、10)的转化子，即霍乱弧菌菌苗候选株IEM104。
本发明中所使用的限制性内切酶、连接酶、地高辛试剂盒和化学试剂等均可在市场上购得。
图1大肠杆菌thyA基因的PCR扩增1．Marker:λDNA/HindⅢ+EcoRⅠ 2．PCR产物(1.13Kb)3．空白对照 4．IEM101为模板的PCR扩增5．Marker:λDNA/HindⅢ图2大肠杆菌thyA基因探针与IEM101染色体DNA在42℃、53℃和68℃杂交结果1．大肠杆菌染色体DNA(阳性对照)2．霍乱弧菌IEM101染色体DNA3．asd基因PCR产物(阴性对照)4．霍乱弧菌395染色体DNAA:42℃ B:53℃ C:68℃图3重组质粒pXXB106酶切鉴定结果1．Marker:λDNA/HindⅢ 2．pXXB106质粒(3.8Kb)3．pUC18质粒图4重组质粒pXXB106的构建1．氨苄青霉素抗性基因2．Lac启动子3．复制起始区4．大肠杆菌thyA基因10．限制性内切酶位点SacⅠ11．限制性内切酶位点SmaⅠ12．限制性内切酶位点HindⅢ 13．限制性内切酶位点SphⅠ15．限制性内切酶位点XbaⅠ16．限制性内切酶位点BamHⅠ17．限制性内切酶位点EcoRⅠ 18．限制性内切酶位点HincⅡ图5质粒的稳定性(平衡系统的稳定性)1．MM改良培养基 2．LB培养基3．含50μg/ml胸腺嘧啶核苷的MM改良培养基图6质粒CT-K63HaeⅢ酶切后与ctxA探针Southern blot杂交结果1．CT-K63质粒 2．CT-K63/HaeⅢ 3．Marker:λDNA/HindⅢ图7重组质粒pXXB110酶切鉴定结果1．Marker:λDNA/HindⅢ2．pXXB110质粒(4.9Kb)3．pXXB108质粒图8重组质粒pXXB110的构建1．氨苄青霉素抗性基因 2．Lac启动子3．复制起始区 4．大肠杆菌thyA基因5．ctx*基因 6．ace基因7．zot基因 9．RSl基因10．限制性内切酶位点SacⅠ 11．限制性内切酶位点SmaⅠ12．限制性内切酶位点HindⅢ 13．限制性内切酶位点SphⅠ16．限制性内切酶位点BamHⅠ 17．限制性内切酶位点EcoRⅠ18．限制性内切酶位点HincⅡ 19．限制性内切酶位点HaeⅢ21．限制性内切酶位点PvuⅠ图9重组质粒pXXB111酶切鉴定结果1．pXXB109质粒 2．pXXB111质粒(3.3Kb)3．Marker:λDNA/HindⅢ图10重组质粒pXXB111的构建1．氨苄青霉素抗性基因3．复制起始区4．大肠杆菌thyA基因 8．ct-B基因10．限制性内切酶位点SacⅠ12．限制性内切酶位点HindⅢ13．限制性内切酶位点SphⅠ16．限制性内切酶位点BamHⅠ17．限制性内切酶位点EcoRⅠ 18．限制性内切酶位点HincⅡ21．限制性内切酶位点PvuⅠ22．限制性内切酶位点BglⅡ
权利要求
1．霍乱弧菌口服活菌苗，其特征在于首先选育出thyA基因缺陷的霍乱弧菌受体菌株，然后构建以thyA基因为选择压力的霍乱弧菌染色体——质粒致死平衡系统，再将无毒的CT*毒素基因ctx*和ct-B基因分别引入，构建成能表达CT*或CT-B的霍乱弧菌抗菌抗毒口服活菌苗。
2．按照权利要求1所述的霍乱弧菌口服活菌苗，其特征是在含有胸腺嘧啶核苷和TMP的MM改良培养基上，选育出霍乱弧菌IEM101菌株的thyA基因缺陷株。
3．按照权利要求1所述的霍乱弧菌口服活菌苗，其特征是用PCR方法获得大肠杆菌的thyA基因。
4．按照权利要求3所述的霍乱弧菌口服活菌苗，其特征是将上述PCR产物与质粒载体pUC18连接，然后转化thyA基因缺陷的霍乱弧菌IEM101菌株，获得含有pXXB106质粒的转化子。
5．按照权利要求1所述的霍乱弧菌口服活菌苗，其特征是用质粒CT-K63上的具有点突变的霍乱弧菌ctx*基因与质粒载体pUC18连接，再将大肠杆菌thyA基因的PCR产物连入，去除大部分Ap基因后，转化thyA基因缺陷的霍乱弧菌IEM101菌株，获得含有全ctx*基因的转化子IEM105。
6．按照权利要求1所述的霍乱弧菌口服活菌苗，其特征是用PCR方法获得霍乱弧菌ct-B基因。
7．按照权利要求6所述的霍乱弧菌口服活菌苗，其特征是将上述PCR产物与质粒载体pUC18连接，再将大肠杆菌thyA基因的PCR产物连入，去除大部分Ap基因后，转化thyA基因缺陷的霍乱弧菌IEM101菌株，获得含有霍乱弧菌ct-B基因的转化子IEM104。
8．按照权利要求5、7所述的霍乱弧菌口服活菌苗，其特征是用霍乱弧菌菌苗候选株IEM104和IEM105制备口服活菌苗。
全文摘要
本发明提供了两株可用于人霍乱病防治的口服活菌苗候选株,其特征在于首先选育出thyA基因缺陷的零乱弧菌IEM101受体菌株,进而构建以thyA基因为选择压力的霍乱弧菌染色体—质粒致死平衡系统,再应用该系统构建了霍乱弧菌抗菌抗毒口服活菌苗候选株,它们能表达霍乱弧菌菌体O抗原和毒素抗原,在兔肠段结扎模型上有较好的安全性、免疫原性和保护力。
文档编号A61K39/106GK1235053SQ9910005
公开日1999年11月17日 申请日期1999年1月4日 优先权日1999年1月4日
发明者祁国明, 夏晓滨, 刘延清 申请人:中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所