专利名称：：水产品中5种致病性弧菌检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
：本发明涉及食品中病原微生物的检测方法，尤其涉及利用mPCR-DHPLC技术检测水产品中致病性弧菌的方法。还涉及检测所使用的组合物，即试剂盒。
背景技术：
：随着生活水平的提高以及我国加入WTO后的逐步开放，人们对水产品的需求不断增大，同时水产品的进出口贸易也在扩大。然而，水产品中致病性微生物、尤其是致病性弧菌的监控和检测一直是限制我国水产品贸易的重要问题之一。1998年和2000年我国出口到法国的鳕鱼片和出口到瑞典的水产品被检出创伤弧菌和拟态弧菌而遭取消代号处理。2001年起我国出口到韩国的水产品全部要求检验霍乱弧菌，因此致病性弧菌的检验越来越受到重视。现有的检测方法中，对水产品中致病性弧菌的检测仍采用常规的微生物检测方法，这些方法费时费力，无法满足快速高通量检测的要求，检测时还会出现假阳性，影响结果分析，可能会带来较大的经济损失。并且，现有的微生物学检验方法无法提供准确的分型信息。而水产品检测中经常是一份样品同时检测几种致病性弧菌。因此，有必要研究一种方法，可同时针对多个致病性弧菌，快速且大批量进行检测，并且能够在检测出时能快速分型。变性高效液相色谱(DHPLC)采用离子对反相高效液相色谱的原理，是通过使用特殊的耐高温液相色谱分离柱同时采用温度调控的方式，对核苷酸片段分子进行分析分离的方法，因此，也有人称该技术为温度调控离子对反相高效液相色谱。该技术的发明为生命科学领域里的核酸分析提供了方便实用的技术平台。其快速高通量、全自动化操作、准确度高、重复性好及敏感性高的优点使其在核酸分析中具有无可替代的优势。DHPLC技术检测微生物是很好的培养不依赖的混合微生物样本的分析平台，不仅能鉴定常见的微生物，还能鉴定不常见的，苛刻的，和厌氧的细菌。该技术在已知和未知基因突变的检测和筛选、基因分型、基因定量和长度多态性分析等领域已经得到广泛应用。本发明人即旨在建立利用DHPLC技术的能快速、高通量检测多样本、多种弧菌的检测方法。
发明内容本发明的目的在于提供一种用于灵敏快捷地检测样品、尤其是检测水产品中致病性弧菌以判定待检样品是否受到污染的mPCR-DHPLC检测试剂盒及其检测方法。首先，本发明所述的水产品中5种致病性弧菌检测试剂盒包括lmL检测溶液含10mMTrisCl、50mMKC1、25mMMgC12、dNTP(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)各2.5mM、TaqDNA聚合酶5000U(5U/WJ及5种致病性弧菌上、下游引物对各10WVI;其中，这5种水产品中致病性弧菌的目的基因及特异性引物序列如下菌株扩增基因引物名称上、下游引物序列(5'-3')产物大小(bp)副溶血弧菌不耐热溶血TXH-FAAAGCGGATTATGCAGAAGCACTG450(V.p)毒素基因TLH-RGCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC溶藻弧菌胶原酶基因VAC陽FCTTATGGGACTTCGGTGATGGCT210(V.a)VAC陽RCGCCCACCGCTTACTTTACTTTG霍乱弧菌胶原酶基因VCC-FCCTAATGAGCAACCGACTATCAAAGA155(V.c)VCC-RTGTTCTGAAGCGGTGAGCCATAC创伤弧菌溶细胞素VVHA-FTTGGTCCATTCGCCAGCAGTTAC582(V.v)基因VVHA-RTGTTGGTTGACGAGCCCGCAGAG拟态弧菌溶血素基因VMH-FAAGGGAAAGTGAATCAGCAGCGAGTA243(V.m)VMH-RCGACCATTTGTTGACGCCCATCT本发明还提供了利用上述试剂盒检测水产品中致病性弧菌的检测方法，包括如下步骤①取lul待测样品DNA溶液，加入10ul试剂盒溶液和14jil灭菌超纯水，总体积25pl;5000r/min离心10s，然后按下列参数进行PCR扩增预变性94°C，3min;进入循环94。C变性60s，56。C退火60s，72'C延伸60s，35次循环；终止延伸72°C，7min;②DHPLC分析色谱柱PS-DVB&C18DNASep色谱柱，4.6mmx50mm，粒度3拜；柱温50°C;流动相(体积比):O.Omin,55.0%缓冲溶液A，45.0%缓冲溶液B;0.5min，50.2%缓冲溶液A，49.8%缓冲溶液B;3.6min，41.8%缓冲溶液A，58.2%缓冲溶液B;6.8min，38.2%缓冲溶液A，61.8%缓冲溶液B;9.9min，36.3%缓冲溶液A，63.7%缓冲溶液B;13min，35.0%缓冲溶液A，65.0%缓冲溶液B;其中，缓冲溶液A是浓度O.lmM的TEAA水溶液；缓冲溶液B是浓度为0.1MTEAA水溶液与乙腈按体积比3:1的混合溶液；流速0.9mL/min;检测器荧光检测器，光源150WXenon灯；激发谱带宽15nm;发射谱带宽15.3nm;检测灵敏度在波长350nm积分2s;上样量PCR产物5pL。检测结束后，根据DHPLC检测图谱中特征色谱峰的峰形、保留时间以及与阳性对照谱图的对照，来确定样品的染菌情况。上述检测方法中所述的待测样品DNA溶液是指用常规的细菌基因组提取的基因组DNA。疑似染菌的样品可以通过常规方法增菌培养后用于提取基因组DNAo本发明采用多重PCR结合变性高效液相色谱(PCR-DHPLC)技术，针对水产品中5类致病性弧菌建立灵敏便捷的检测方法，并建立水产品中5类致病性弧菌快速检测试剂盒。本方法检测5类致病性弧菌检测下限低于100cfU/mL，只要每毫升菌液里各致病性弧菌数有100个，用本方法就可以检测出来。此外，本方法检侧时间比传统方法短，方法更加简捷，可以节省大量的劳力和财力，适合快速检测的要求。本发明附图6幅，其中图1是mPCR-DHPLC方法特异性试验中拟态弧菌的检测图；图2是mPCR-DHPLC方法特异性试验中创伤弧菌的检测图谱；图3是mPCR-DHPLC方法特异性试验中副溶血弧菌的检测图谱；图4是mPCR-DHPLC方法特异性试验中溶藻弧菌的检测图谱；图5是mPCR-DHPLC方法特异性试验中霍乱弧菌的检测图谱；图6是5类致病性弧菌的mPCR-DHPLC检测结果；上述附图中，横坐标均为保留时间(单位分钟min)，纵坐标表示吸收峰信号强度(单位毫伏mV)。具体实施例方式下面为本发明的具体实施例，其对本方法的建立及其应用作进一步的说明，但并不以任何形式限制本发明的内容。若无特殊说明，本部分所使用的主要试剂、仪器及其商品来源为MgCl2，纯度大于99.9%,购自美国Ameresco公司；KC1，纯度大于99.9%，购自美国Ameresco公司；Trizmabase，纯度大于99.9%，购自美国Ameresco公司；甘油，纯度大于99.9%，购自美国Ameresco公司；细菌基因组DNA提取试剂盒，购自天根生化科技有限公司；DNAmarkerI购自天根生化科技有限公司；dNTP(dATP、dTTP、dGTP和dCTP等摩尔混合物，各10mmol/L)，购自天根生化技术有限公司；5xBuffer(含15mmol/LMgCl2)，购自Promega公司；GoTaqDNA聚合酶(5U/VL)，购自Promega公司；2xTaqPCRMasterMix(0.1UTaqPolmerase4iL，500(imol/LDNTPeach,20mmol/LTris隱HCLpH=8.3，100mmol/LKCL，3mmol/LMgC12)，购自天根生化科技有限公司。PCR仪德国Biometm公司生产的梯度PCR仪(型号为Tgradient96)及MJResearch公司生产的4槽PCR仪(型号为PTC220);凝胶成像仪美国KODAK公司生产(型号为KODAK);核酸蛋白分析仪英国安玛西亚公司生产(型号为Ultrospec1100pro);台式离心机德国eppendorf公司生产(型号为Minispin);培养箱美国LBA-LINE仪器有限公司生产的LBA-LINE3554-26广温培养箱；变性高效液相色谱仪美国Tmnsgenomic公司生产(型号WAVE4500);VITEK全自动细菌鉴定仪；DNA/RNA真空浓縮仪；本部分内容涉及的标准菌株及标准菌株基因组DNA分别购自美国标准生物品收藏中心(ATCC)和中国医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC)，详见表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>33肠致病性大肠埃希氏菌ATCC4388734肠侵袭性大肠埃希氏菌ATCC4389335阪崎肠杆菌ATCC5132936福氏忐贺氏菌幼—〃aATCC1202237金黄色葡萄球菌ATCC2921338金黄色葡萄球菌&ap/2>7oc:oc:cz^"脏W5aw/^uyATCC4944439小肠结肠炎耶尔森氏菌ATCC961040溶血性链球菌CMCC3212141普通变形杆菌ATCC4902742奇异变形杆菌ATCC2924543空肠弯曲菌ATCC3356044空肠弯曲菌ATCC3329145空肠弯曲菌基因组DNAC纖/—勿,聽'5W/wp.ATCCgewo鼎:cZ)假33560D-546蜡样芽孢杆菌ATCC1457947产气荚膜梭菌ATCC13124使用前，取表l中所列试验菌种，经培养后分别提取基因组DNA，建立模板库。弧菌接种于4mL3XNaCl营养肉汤中(37iiyC培养1824h，弯曲菌属的菌株在布氏肉汤中，于42"C微需氧环境下培养(5M氧气、10%二氧化碳和85%氮气)24h。其他的菌株在营养肉汤中，于37r培养24h。实施例1、水产品中5种致病性弧菌检测试剂盒及其检测方法的建立本实施例确定用于检测的目的基因及其引物如下表所示菌株扩增基因引物名称上、下游引物序列(5'—3')产物大小(bp)副溶血弧菌不耐热溶血TLH-FAAAGCGGATTATGCAGAAGCACTG450(V.p)毒素基因TLH-RGCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC溶藻弧菌胶原酶基因VAC-FCTTATGGGACTTCGGTGATGGCT210(V.a)VAC-RCGCCCACCGCTTACTTTACTTTG霍乱弧菌胶原酶基闲VCC-FCCTAATGAGCAACCGACTATCAAAGA155(V.c)VCC-RTGTTCTGAAGCGGTGAGCCATAC创伤弧菌溶细胞素WHA-FTTGGTCCATTCGCCAGCAGTTAC582(V.v)基因VVHA隱RTGTTGGTTGACGAGCCCGCAGAG拟态弧菌溶血素基因VMH-FAAGGGAAAGTGAATCAGCAGCGAGTA243(V.m)_VMH-RCGACCATTTGTTGACGCCCATCT_在此基础上，设计用于PCR扩增的水产品中5种致病性弧菌检测试剂盒lmL检测溶液含10mMTris.Cl、50mMKC1、25mMMgC12、dNTP(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)各2.5mM、TaqDNA聚合酶5UL及上表中5种致病性弧菌引物对各10|iM。使用该试剂盒检测样品中5种致病性弧菌的mPCR-DHPLC方法包括如下步骤①待测样品DNA溶液的制备a.水产品样品无菌方法称取25克样品于225mL3%氯化钠营养肉汤中培养1824h，使用细菌基因组提取试剂盒提取其基因组DNA，制取PCR模板。标记，直接作为PCR模板或-2(TC保存。b.标准菌株挑取单个菌落，弧菌接种于3Q/^NaCl营养肉汤中(37士1)"C培养1824h，弯曲菌属的菌株在布氏肉汤中，于42"C微需氧环境下培养(5%氧气、10%二氧化碳和85%氮气)24h。其他的菌株在营养肉汤中，于37'C培养24h。使用细菌基因组提取试剂盒提取其基因组DNA，制取PCR模板。标记，直接作为PCR模板或-2(TC保存。②取lul待测样品DNA溶液，加入10ul试剂盒溶液和14pl灭菌超纯水，总体积25iil;5000r/min离心10s，然后按下列参数进行PCR扩增预变性94°C，3min;进入循环94。C变性60s，56。C退火60s，72"C延伸60s,35次循环;终止延伸72°C，7min;③DHPLC分析色谱柱PS-DVB&C18DNASep色谱柱，4.6mmx50mm，粒度3pm;柱温50°C;流动相(体积比)O.Omin，55.0%缓冲溶液A，45.0%缓冲溶液B;0.5min，50.2%缓冲溶液A，49.8%缓冲溶液B;3.6min，41.8%缓冲溶液A，58.2%缓冲溶液B;6.8min，38.2%缓冲溶液A，61.8%缓冲溶液B;9.9min，36.3%缓冲溶液A，63.7%缓冲溶液B;13min，35.0%缓冲溶液A，65.0%缓冲溶液B;其中，缓冲溶液A是浓度O.lmM的TEAA水溶液;缓冲溶液B是浓度为O.IMTEAA水溶液与乙腈按体积比3:1的混合溶液；流速0.9mL/min;检测器荧光检测器，光源150WXenon灯；激发谱带宽15nm;发射谱带宽15.3nm;检测灵敏度在波长350nm积分2s;上样量PCR产物5pL。实施例2、特异性试验取表l中所列试验菌种，经培养后分别提取基因组DNA，建立模板库。然后以这些基因组DNA为模板，以霍乱弧菌的胶原酶基因(vcc)、拟态弧菌的溶血素基因(vmh)、副溶血弧菌的不耐热溶血毒素基因(tlh)、溶藻弧菌的胶原酶基因(vac)及创伤弧菌的溶细胞素基因(vvh)为检测的目的基因采用实施例1所建立的试剂盒及检测方法进行mPCR-DHPLC检测。5类致病性弧菌DHPLC特异性检测图谱如附图16所示。结果显示，在mPCR反应体系中，a.拟态弧菌全部扩增出了vmh目的基因片段，而其他非拟态弧菌菌株则全部为阴性结果(附图1);b.创伤弧菌全部扩增出了vvh目的基因片段，而非创伤弧菌菌株则全部为阴性结果(附图2);c.副溶血弧菌全部扩增出tlh目的基因片段，而非副溶血弧菌菌株则全部为阴性结果(附图3);d.溶藻弧菌扩增得到vac目的基因片段，其余非溶藻弧菌菌株全部为阴性结果(附图4)。e.霍乱弧菌扩增得到vcc目的基因片段，其余非霍乱弧菌菌株全部为阴性结果(附图5)。上述结果表明本实验设计的5重引物适用于mPCR-DHPLC检测5类致病性弧菌，具有很好的特异性。实施例3、同时检测5种致病性弧菌的mPCR-DHPLC检测试验、溶藻弧菌ATCC17749、霍乱弧菌ATCC14035标准菌株在36°C培养18h，测其OZ)值，估计其菌数，然后按10—1，10—2，10—3等倍数梯度稀释，取几个适宜梯度的菌液进行平板计数，重复2次，取平均值确定其菌浓度。取几个适宜梯度的菌液，采用试剂盒提取法制备基因组DNA，制备待测样品DNA溶液，采用上述条件进行mPCR-DHPLC分析检测。测量结果的DHPLC谱图如附图6所示。由该结果可见，5类致病性弧菌的mPCR-DHPLC行为具有明显的差异，本发明的试剂盒及检测方法可以在一次检测中非常有效地将染菌样品中的这5种菌区分识别。实施例4、灵敏度试验分别取拟态弧菌ATCC33653、创伤弧菌ATCC27562、副溶血弧菌ATCC17803、溶藻弧菌ATCC17749、霍乱弧菌ATCC14035标准菌株在36°C培养18h，测其OZ)值，估计其菌数，然后按10—1，10—2，10—3等倍数梯度稀释，取几个适宜梯度的菌液进行平板计数，重复2次，取平均值确定其菌浓度。将适当浓度的5种菌液混合，并按1(T1，10_2进行倍数梯度稀释，形成三个混合菌液系列(如表2)，每个系列梯度菌液采用试剂盒提取法制备模板DNA，进行PCR-DHPLC检测，确定反应体系的灵敏度。表2拟态弧菌创伤弧菌副溶血弧菌溶藻弧菌霍乱弧菌(CFU/mL)(CFU/mL)(CFU/mL)(CFU/mL)(CFU/mL)系列182006700370052003500系列2820670370520350系列38267375235结果表明，在5类致病性弧菌的混合液中，当菌液浓度为拟态弧菌82CFU/mL、创伤弧菌67CFU/mL、副溶血弧菌37CFU/mL溶藻弧菌52CFU/mL霍乱弧菌35CFU/mL时，各类致病性弧菌依然可被检出。实施例5、应用于食品检测试验2007年11月2008年5月，将实施例1所建立的试剂盒及mPCR-DHPLC的检测方法用于海产品中弧菌的检测，同时采用标准方法(GB/T4789.7-2003、SN/T1022-2001、MNKLNo.156)进行比较。共检测196份样品，包括鱿鱼及其加工产品、虫下仁、黑鲳、午鱼、鱼肚、鱼鳍、鲨鱼肉、鲣鱼、金枪鱼、秋刀鱼和带鱼等。对mPCR-DHPLC检测结果结果的判断标准是将待测样品的PCR-DHPLC检测谱图与阴性对照及阳性对照(标准菌株)的PCR-DHPLC检测谱图比较，当阴性对照无任何特异性吸收峰出现，而阳性对照出现位置正确的特异性吸收峰时，若被检样品在与阳性扩增的同一位置上出现特异性吸收峰，且峰高>2mV时，判定为阳性；若被检样品在该位置无特异性吸收峰，则判定为阴性；若被检样品在与阳性扩增的同一位置上出现特异性吸收峰，但峰高<2mV时，则为可疑样品，需要通过其他方法进行确认。试验统计结果如表4:<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>经统计，用实施例1所建立的试剂盒及mPCR-DHPLC方法检出的12份阳性样本采用经典的标准方法验证，均证实为阳性。mPCR-DHPLC方法检测出的阴性结果与标准方法结果符合。试验中mPCR-DHPLC方法吻合率为100%，显示该方法具有广泛而且良好的适用性。本实施例中，使用传统培养的方法，检测每个样品平均总耗时(包括样品制备)96h，检测耗时(不包括样品制备)94h;使用mPCR-DHPLC方法，检测每个样品平均总耗时(包括样品制备)25h，检测耗时(不包括样品制备)0.5h。权利要求1、水产品中5种致病性弧菌检测试剂盒，其特征在于1mL检测溶液含10mMTris·Cl、50mMKCl、25mMMgCl2、dNTP各2.5mM、TaqDNA聚合酶5U/μL及5种致病性弧菌引物对各10μM；其中，5种致病性弧菌的特异性引物序列如下<tablesid="tabl0001"num="0001"wi="138"></tables>2、水产品中5种致病性弧菌的检测方法，其特征在于使用如权利要求1所述的试剂盒，包括如下步骤①取lul待测样品DNA溶液，加入10ul试剂盒溶液和14|il灭菌超纯水，总体积25pl;5000r/min离心10s，然后按下列参数进行PCR扩增预变性94°C，3min;进入循环94。C变性60s，56'C退火60s，72°。延伸60s，35次循环;终止延伸72°C，7min;②DHPLC分析色谱柱PS-DVB&C18DNASep色谱柱，4.6mmx50mm，粒度3柱温50°C;<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>,6.8min，38.2%缓冲溶液A，61.8%缓冲溶液B;9.9min，36.3%缓冲溶液A，63.7%缓冲溶液B;13min，35.0%缓冲溶液A，65.0%缓冲溶液B;其中，缓冲溶液A是浓度0.1mM的TEAA水溶液；缓冲溶液B是浓度为0.1MTEAA水溶液与乙腈按体积比3:1的混合溶液；流速0.9mL/min;检测器荧光检测器，光源150WXenon灯；激发谱带宽15nm;发射谱带宽15.3nm;检测灵敏度在波长350nm积分2s;上样量PCR产物5pL。全文摘要一种用于食品微生物污染检测及监控的水产品中5种致病性弧菌检测试剂盒及其检测方法，所述的试剂盒中，1mL检测溶液含10mMTris·Cl、50mMKCl、25mMMgCl<sub>2</sub>、dNTP各2.5mM、TaqDNA聚合酶5U/μL及5种致病性弧菌引物对各10μM。采用本发明的试剂盒及检测方法，可以一次检测出水产品中5类致病性弧菌。并且检测下限低于100cfu/mL，只要每毫升菌液里各致病性弧菌数有100个，用本方法就可以检测出来。此外，本方法检侧时间比传统方法短，方法更加简捷，可以节省大量的劳力和财力，适合快速检测的要求。文档编号C12Q1/68GK101633952SQ20091001079公开日2010年1月27日申请日期2009年3月20日优先权日2009年3月20日发明者邵碧英,晶郑,黄晓蓉申请人:邵碧英;郑晶;黄晓蓉