一种检测致病菌的试剂盒及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种检测致病菌的试剂盒及其应用，涉及生物学免疫方法的检测【技术领域】。上述试剂盒，包括下列试剂：金纳米粒子、抗致病菌抗体、阿朴色氨酸酶、抗致病菌抗体标记的纳米磁珠。本发明还提供上述试剂盒在检测致病菌方面的应用及检测方法。采用本发明检测致病菌的试剂盒，能够简单、快速、灵敏、原位检测致致病菌。
【专利说明】一种检测致病菌的试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物学免疫方法的检测【技术领域】，具体涉及一种检测致病菌的试剂盒方法及其应用。
技术背景
[0002]致病菌(Pathogenic bacteria)是指能引起疾病的微生物。致病菌包括细菌、病毒、螺旋体、立克次氏体、衣原体、支原体、真菌及放线菌等。一般所说的致病菌指的是病原微生物中的细菌。细菌的致病性与其毒力、侵入数量及侵入门户有关。虽然绝大多数细菌是无害甚至有益的，但是相当大一部分可以致病。条件致病菌只在特定条件下致病，如有伤口可以允许细菌进入血液，或者免疫力降低时。
[0003]例如:空肠弯曲菌是多种动物如牛、羊、狗及禽类的正常寄居菌。在它们的生殖道或肠道有大量细菌，故可通过分娩或排泄物污染食物和饮水。空肠弯曲菌是一种人畜共患病病原茵，可以引起人和动物发生多种疾病，并且是一种食物源性病原茵，被认为是引起全世界人类细菌性腹泻的主要原因。主要症状为腹泻和腹痛，有时发热，偶有呕吐和脱水。人群普遍易感，5岁以下儿童的发病率最高，夏秋季多见。空肠弯曲菌有内毒素能侵袭小肠和大肠粘膜引起急性肠炎，亦可引起腹泻的暴发流行或集体食物中毒。潜伏期一般为3~5天，对人的致病部位是空肠、回肠及结肠。大肠埃希氏菌(/?.co7i)通常称为大肠杆菌，是Escherich在1885年 发现的,分布在自然界。虽然绝大多数大肠杆菌与人类有着良好合作，但是仍有少部分特殊类型的大肠杆菌具有相当强的毒力，一旦感染，将造成严重疫情。其中最具代表性的就是代号为0157:H7的大肠杆菌，它是EHEC (肠出血性大肠杆菌)家族中的一员。人体感染EHEC后，会发生严重的痉挛性腹痛和反复发作的出血性腹泻，同时伴有发热、呕吐等表现，多为EHEC产生的毒素所致。某些严重感染者毒素随血行播散造成溶血性贫血，红细胞、血小板减少；肾脏受到波及时还会发生急性肾功能衰竭甚至死亡。
[0004]目前检测致病菌的常见方法有:平板培养法、仪器法、免疫层析试纸条法等。但这些方法操作复杂，对检测环境或仪器要求高，耗时较长，如平板法费时且环境要求严格，仪器法既昂贵又繁琐。
[0005]
【发明内容】
:
本发明的目的在于提供一种检测致病菌的试剂盒，能够简单、快速、灵敏、原位检测致病菌。
[0006]本发明的另一目的是提供上述试剂盒在检测致病菌方面的应用。
[0007]本发明的再一目的是提供采用上述试剂盒检测致病菌的方法，该方法简单、快速、灵敏、特异性强，且能够实现原位检测。
[0008]本发明的目的采用如下技术方案实现。
[0009]一种检测致病菌的试剂盒，包括下列试剂:金纳米粒子、抗致病菌抗体、阿朴色氨酸酶、抗致病菌抗体标记的纳米磁珠。
[0010]在本发明中，所述试剂盒还包括牛血清白蛋白溶液和反应物溶液，所述反应物溶液含有L-色氨酸和磷酸吡哆醛。
[0011 ] 在本发明中，所述致病菌为大肠杆菌或空肠弯曲菌。
[0012]在本发明中，所述抗体为单克隆抗体。
[0013]本发明还提供上述试剂盒在检测致病菌方面的应用。
[0014]本发明还提供采用上述试剂盒检测致病菌的方法，包括如下步骤:
(1)金纳米粒子的表面同时吸附阿朴色氨酸酶和抗致病菌抗体，得到酶抗体复合物；
(2)抗致病菌抗体标记的纳米磁珠与待测样品混合，离心，取沉淀；
(3)将步骤(2)所述沉淀加入步骤(1)所述酶抗体复合物中，磁性分离纳米磁珠；
(4)将步骤(3)所述纳米磁珠加入到所述反应物溶液中进行反应；
(5)通过检测步骤(4)反应后混合物中的吲哚，对致病菌进行定性或定量检测。
[0015]在本发明中，所述致病菌为大肠杆菌或空肠弯曲菌。
[0016]本发明中致病菌指的是病原微生物中的细菌。
[0017]与现有技术相比，本发明的有益效果如下: 1、本发明试剂盒包括金纳米粒子、抗致病菌抗体、阿朴色氨酸酶、抗致病菌抗体标记的纳米磁珠。采用本发明试剂盒检测致病菌的原理:如果待测样品中含有目标致病菌，那么金纳米粒子、抗致病菌抗体、阿朴色氨酸酶复合物能够与目标致病菌、抗致病菌抗体标记的纳米磁珠形成双抗夹心结构的复合物，磁性分离纳米磁珠，获得双抗夹心结构的复合物，通过阿朴色氨酸酶催化L-色氨酸反应产生有气味的吲哚，对目标致病菌进行定性或定量检测。由于本发明检测方法，使用了可特性识别致病菌的抗体，因而具有特异性高、稳定性好的特点。另外，本发明方法还具有简单、快速、灵敏、能原位检测致病菌的优点。
[0018]2、本发明为通用型方法，只需要替换特异性识别致病菌的单克隆抗体，即可实现对任意致病菌的快速、现场检测，应用范围广，简单易于推广应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1显示了本发明检测方法的原理。
[0020]图2是本发明试剂盒检测空肠弯曲菌的特异性的柱状图。
[0021]图3是本发明试剂盒检测大肠杆菌的特异性的柱状图。
【具体实施方式】
[0022]本发明中室温是指20-25 °C。
[0023]PBS缓冲液:取 137 mmol NaCl,2.7 mmol KClUO mmol Na2HPO4和 2 mmol KH2P04溶于水，调节pH至7.4，用水定容至1L。
[0024]PBST缓冲液:在PBS缓冲液中添加终浓度为0.05% (质量百分浓度)吐温一20。
[0025]KDP缓冲液:取0.2mol磷酸钾和7 mmol硫酸铵溶于水，调节pH至?.8，用水定容至IL0
[0026]实施例1检测空肠弯曲菌的试剂盒
检测空肠弯曲菌的试剂盒包括如下试剂:金纳米粒子溶液、抗空肠弯曲菌抗体、阿朴色氨酸酶溶液、抗空肠弯曲菌抗体标记的纳米磁珠，牛血清白蛋白溶液和反应物溶液。所述反应物溶液含有L-色氨酸和磷酸吡哆醛。[0027](I)金纳米粒子溶液
金纳米粒子溶液的浓度为10 mM,金纳米粒子平均粒径为15 nm。
[0028]金纳米粒子的制备方法:在锥形瓶中加5 mL、I g/L的氯金酸溶液，然后用灭菌水稀释到50 mL，在搅拌状态下加热至暴沸，加入0.6?I mL浓度为1% (质量百分浓度)的柠檬酸钠溶液，持续搅拌，至溶液颜色稳定至酒红色。
[0029](2)抗空肠弯曲菌单克隆抗体
抗空肠弯曲菌单克隆抗体的浓度为0.1 mg/mL,购自abeam,产品编号ab31468,抗空肠弯曲菌单克隆抗体效价1:200，抗致空肠弯曲菌单克隆抗体亲和常数1.2X101(IL/M。
[0030]( 3 )阿朴色氨酸酶溶液
阿朴色氨酸酶溶液的浓度为0.1 mg/mL，购自sigma公司，产品编号A6007。
[0031](4)抗空肠弯曲菌单克隆抗体标记的纳米磁珠
纳米磁珠采用如下方法制备:取1.08 g氯化铁和0.2 g柠檬酸三钠溶于20 mL乙二醇，然后加入1.2 g乙酸钠，搅拌30 min，置200°C油浴中保温10小时，得到浓度为10 mM的纳米磁珠。
[0032]抗空肠弯曲菌单克隆抗体标记的纳米磁珠的制备方法如下:取10 mM的纳米磁珠60 μ L、0.1mM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液15 yL和
0.0lmM的N-羟基丁二酰亚胺(NHS)溶液15 μ L，混合，室温下反应10-30分钟；加入0.01mg抗空肠弯曲菌抗体(来源同本实施例标题(2))，混合，室温下反应2-4小时，即得抗空肠弯曲菌单克隆抗体标记的纳米磁珠。
[0033]( 5 )牛血清白蛋白溶液
牛血清白蛋白溶液的质量百分浓度10%。
[0034](6)反应物溶液
反应物溶液:取20 mmol L-色氨酸(阿拉丁试剂)和0.2 mmol磷酸卩比唆醒(阿拉丁试齐U)溶于水，用水定容至1L。
[0035]实施例2本发明检测空肠弯曲菌试剂盒的应用
采用实施例1制备的试剂盒检测空肠弯曲菌的具体步骤如下:
(I)阿朴色氨酸酶与抗空肠弯曲菌抗体结合
1)取5mL金纳米粒子溶液，用0.2 mo I/L的K2CO3溶液调节pH值至8.0 ;
2)在调节好pH值的金纳米粒子溶液中加入500μ L抗空肠弯曲菌单克隆抗体和500μL阿朴色氨酸酶溶液，混合，室温下振荡反应I小时；
3)加入500μ L牛血清白蛋白溶液，混合，室温下振荡反应30分钟；
4)取出反应溶液，在9.4 g的离心力下离心7分钟，取沉淀重悬于500 μ L PBST缓冲液中，得到酶抗体复合物，放置于4°C环境中，贮存。酶抗体复合物制备后，必须在12个小时小时内使用。
[0036](2)空肠弯曲菌的现场检测
1)取IHiL抗空肠弯曲菌抗体标记的纳米磁珠，用PBS缓冲液清洗，然后用300 μ L PBS缓冲液重悬；
2)在步骤I)重悬后的溶液中加入200μ L浓度为100 cfu/mL空肠弯曲菌(ATCC33560，购自北京中原公司)溶液，在室温中孵育30分钟； 3)将步骤2)所得溶液离心，取沉淀，用PBS缓冲液清洗，然后用PBS缓冲液重悬；
4)取150UL步骤(I)制备好的酶抗体复合物加入到步骤3)重悬后的溶液中，在室温下孵育30分钟，离心，取沉淀；
5)用500uL PBS缓冲液清洗步骤4)所得沉淀3次，最终悬浮于200 μ L的KDP缓冲液；
6)磁性分离步骤5)中KDP缓冲液悬浮液，获得纳米磁珠复合物；将纳米磁珠复合物加入到500 μ L反应物溶液中，在室温下放置在旋转混合仪上使其混合反应60分钟；
7)通过人的嗅觉判断步骤6)反应是否产生了吲哚，如果产生了吲哚，说明待测样品中含有目标致病菌。另外，还可以通过PGM-30电子鼻(美国RAE公司)定性或定量分析步骤
6)反应后溶液中的吲哚，从而对待测样品中空肠弯曲菌进行定性或定量分析，具体操作过程见电子鼻说明书。
[0037]采用本发明试剂盒检测空肠弯曲菌，灵敏度可达到IO1-1O2 cfu。由于检测过程中单克隆抗体与致病菌存在特异性的结合，所以本发明试剂盒的特异性高，发明人经过试验也证明采用本发明试剂盒可以检出空肠弯曲菌，不能检出志贺菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。
[0038]实施例3检测大肠杆菌的试剂盒
检测大肠杆菌的试剂盒与实施例1中检测空肠弯曲菌试剂盒相比，区别仅在于以抗大肠杆菌单克隆抗体替代抗空肠弯曲菌单克隆抗体，以抗大肠杆菌单克隆抗体标记的纳米磁珠替代抗空肠弯曲菌单克隆抗体标记的纳米磁珠。
[0039]( I)抗大肠杆菌单克隆抗体
抗大肠杆菌单克隆抗体的浓度为0.1 mg/mL,购自Thermo Scientific Pierce,产品编号MA1-7029，抗大肠杆菌单克隆抗体效价1:20，抗大肠杆菌单克隆抗体亲和常数
2.8X108L/M
(2)抗大肠杆菌单克隆抗体标记的纳米磁珠
抗大肠杆菌单克隆抗体标记的纳米磁珠的制备方法如下:取10 mM的纳米磁珠(制备方法同实施例1)60 uU0.1mM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液15 UL和0.0lmM的N-羟基丁二酰亚胺(NHS)溶液15 μ L，混合，室温下反应10-30分钟；加入0.01 mg抗大肠杆菌单克隆抗体(来源同本实施例标题(1))，混合，室温下反应2-4小时，即得。
[0040]实施例4本发明检测大肠杆菌试剂盒的应用 采用本发明检测大肠杆菌试剂盒检测的具体步骤:
(O阿朴色氨酸酶与抗大肠杆菌抗体结合
1)取5mL金纳米粒子溶液，用0.2 mo I/L的K2CO3溶液调节其pH值至8.0 ;
2)在调节好pH值的金纳米粒子溶液中加入500μ L抗大肠杆菌单克隆抗体和500 μ L阿朴色氨酸酶溶液，混合，室温下振荡反应I小时；
3)加入500μ L牛血清白蛋白溶液，混合，室温下振荡反应30分钟；
4)取出反应溶液，在9.4 g的离心力下离心7分钟，取沉淀重悬于500 μ L PBST缓冲液中，得到酶抗体复合物，放置于4°C环境中贮存。酶抗体复合物制备后，必须在12个小时内使用。[0041](2)大肠杆菌的现场检测
1)取IHiL抗大肠杆菌单克隆抗体标记的纳米磁珠，用PBS缓冲液清洗，然后用300 ULPBS缓冲液重悬；
2)在步骤I)重悬后的溶液中加入200μ L浓度为100 cfu/mL大肠杆菌(株名是ATCC25922，购自北京中原公司)溶液，在室温中孵育30分钟；
3)将步骤2)所得溶液离心，取沉淀，用PBS缓冲液清洗，然后用PBS缓冲液重悬；
4)取150UL步骤(I)中制备好的酶抗体复合物加入到步骤3)重悬后的溶液中，在室温下孵育30分钟，离心，取沉淀；
5)用500μ L PBS缓冲液清洗步骤4)所得沉淀3次，最终悬浮于200 μ L的KDP缓冲液中；
6)磁性分离步骤5)获得的KDP缓冲液悬浮液，获得纳米磁珠复合物；将纳米磁珠复合物加入到500 μ L反应物溶液中，在室温下温和的混合反应60分钟；
7)通过人的嗅觉判断步骤6)反应是否产生了吲哚，如果产生了吲哚，说明待测样品中含有目标致病菌。另外，还可以通过电子鼻定性或定量分析吲哚，从而对待测样品中大肠杆菌进行定性或定量分析。
[0042]采用本发明试剂盒检测大肠杆菌，灵敏度可达到IO1-1O2 cfu。由于检测过程中单克隆抗体与致病菌存在特异性的结合，所以本发明试剂盒的特异性高，发明人经过试验也证明采用本发明试剂盒可以检出大肠杆菌，不能检出志贺菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。
【权利要求】
1.一种检测致病菌的试剂盒，包括下列试剂:金纳米粒子、抗致病菌抗体、阿朴色氨酸酶、抗致病菌抗体标记的纳米磁珠。
2.根据权利要求1所述检测致病菌的试剂盒方法，其特征在于所述试剂盒还包括牛血清白蛋白溶液和反应物溶液，所述反应物溶液含有L-色氨酸和磷酸吡哆醛。
3.根据权利要求2所述检测致病菌的试剂盒方法，其特征在于所述致病菌为大肠杆菌或空肠弯曲菌。
4.根据权利要求1或2或3所述检测致病菌的试剂盒方法，其特征在于所述抗体为单克隆抗体。
5.权利要求1-4之一所述检测致病菌的试剂盒在检测致病菌方面的应用。
6.采用权利要求1-4之一试剂盒检测致病菌的方法，包括如下步骤: (1)金纳米粒子的表面同时吸附阿朴色氨酸酶和抗致病菌抗体，得到酶抗体复合物； (2)抗致病菌抗体标记的纳米磁珠与待测样品混合，离心，取沉淀； (3)将步骤(2)所述沉淀加入步骤(I)所述酶抗体复合物中，磁性分离纳米磁珠； (4)将步骤(3)所述纳米磁珠加入到所述反应物溶液中进行反应； (5)通过检测步骤(4)反应后混合物中的吲哚，对致病菌进行定性或定量检测。
7.根据权利要求6所述检测致病菌的方法，其特征在于所述致病菌为大肠杆菌或空肠弯曲囷。
【文档编号】G01N33/569GK103983783SQ201410254656
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年6月10日 优先权日:2014年6月10日
【发明者】薛峰, 滕军, 蒋原, 陈伟, 李东明, 曾德新, 夏晓莉, 邵景东 申请人:江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心