食源性致病菌五重荧光pcr检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及食源性致病菌五重荧光PCR检测试剂盒和检测方 法。 技术背景
[0002] 民以食为天，食以安为先。食品安全与人们的生活息息相关，食品安全没有保障， 不仅会影响人类的健康与生存，而且还会严重影响社会与经济的发展。2000年世界卫生大 会通过了《食品安全决议》，制定了全球食品安全战略，将食品安全列为公共卫生的优先领 域。但是食品安全事件时有发生，特别是近年来，由食源性致病菌引起的食物中毒事件在世 界范围内大多数国家的发生率显著上升，已成为一个重要的公共卫生问题。引起食源性疾 病的金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌和志贺氏菌等致病菌，很容 易通过直接或间接对食物进行污染，导致中毒事件频发。如2009年1月美国的鼠伤寒沙门 菌花生酱污染事件，波及43个州，致3人死亡。快速、准确地检测和鉴定食源性致病菌是 有效地控制与预防食源性疾病爆发的前提条件。但是有关食源性致病菌快速检测技术平台 在我国还比较薄弱，加强食源性致病菌快速检测技术平台的建设具有重要的经济和社会意 义。
[0003] 目前食源性致病菌检测的"金标准"还是传统的分离培养方法，但其检测周期长、 检测程序繁琐，不能达到快速检测的目的。实时荧光PCR技术是1996年由美国ABI公司 推出的一种新型检测技术，由于实时荧光PCR技术具有特异性强、灵敏度高、简便快速等 优点，在食源性致病菌检测方面已取得了丰硕的成果。但是目前运用于食源性致病菌检测 的实时荧光PCR检测试剂盒大部分是基于Taqman探针技术开发的，不但检测成本高，而 且进行多重检测时对实时荧光PCR仪的通道数量有一定的要求。熔解曲线（resolution melting)技术是不同于探针技术的又一种实时荧光PCR检测技术，在常规PCR的基础上加 入荧光染料，当荧光染料与DNA双链结合时，发出荧光；从DNA双链上释放出来时，荧光信号 急剧减弱，如果升高温度使DNA变性，以温度为横坐标对荧光信号作图，可得到熔解曲线。 把50%DNA分子发生变性的温度称为融点温度（melting temperature, Tm)。如果扩增产物 长度不同、其GC比值不同，进行溶解分析时就会有其独特的熔解曲线，并且熔解曲线性质、 位置和Tm值都是不同的。如果不同病原菌扩增产物长度不同、其GC比值不同，进行熔解分 析时就会有其独特的熔解曲线。由于早期使用的荧光染料SYBR Green I为不饱和染料，稳 定性差而且存在着染料重分布问题，从而限制了熔解曲线技术的应用。随着饱和荧光染料 LC Green和Eva Green的发明，解决了不饱和染料稳定性差而且存在着染料重分布的问题， 基于熔解曲线技术的多重荧光PCR已经在检验检测领域显示出了巨大的优势。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种基于熔解曲线技术的食源性致病菌五重实时荧光PCR 检测试剂盒，通过一次反应快速、经济和可靠的完成金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、沙门 氏菌、副溶血性弧菌和志贺氏菌等五种食源性致病菌的检测。
[0005] 本发明基于熔解曲线技术，以金黄色葡萄球菌的nuc基因、单增李斯特菌的hlyA 基因、沙门氏菌的invA基因、副溶血性弧菌的tlh基因和志贺氏菌的ipaH基因为靶基因。
[0006] 食源性致病菌五重实时荧光PCR检测试剂盒包括五对特异性引物、EvaGreen PCR 预混液、超纯水和阳性对照，其中EvaGreen PCR预混液包括PCR缓冲液、dNTP混合物、DNA 聚合酶和饱和荧光染料EvaGreen，阳性对照为金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、沙门氏菌、 副溶血性弧菌和志贺氏菌标准菌株DNA提取液。超纯水可同时作为阴性对照。
[0007] 所述五对特异性引物的序列如下： nuc 上游引物：5' -AACAAGATCGCTATGGTAGAACATTGGC-3' nuc 下游引物：5' -CTTCTCTCTAGCAAGTCCCTTTTCCACTA-3' hlyA 上游引物：5' -AAAAGCAAGTTAGCTCATTTCACATCGT-3' hlyA 下游引物：5' -TTACCGTTCTCCACCATTCCCAAG-3' invA 上游引物：5' -CAATCAGTCCTAACGACGACCCTTC-3' invA 下游引物：5' -GCCGCCAAACCTAAAACCAGC-3' tlh 上游引物：5' -CGAACGAGAACGCAGACATTACG-3' tlh 下游引物：5' -CGGGTTAGGGAAGCGCCATT-3' ipaH 上游引物：5' -GGTAAATCTGCTGTTCAGTCTCACGC-3' ipaH 下游引物：5' -TTTACGGACTGGTTCTCCCTCTGG-3'。
[0008] 本发明的关键在于扩增引物的设计，染料类实时荧光PCR能用于多重检测是因为 如果不同的扩增产物长度不同、其GC比值不同，进行溶解曲线分析时就会有其独特的溶解 曲线，并且溶解曲线性质、位置和Tm值都是不同的。因此引物设计时不但要采用blast分 析保证引物的特异性，还要考虑扩增产物的长度和GC比值，保证进行溶解曲线分析时不同 的靶基因的能产生具有不同Tm值的溶解曲线。除引物外本发明所需其他试剂，如EvaGreen PCR预混液，包括PCR缓冲液、dNTP混合物、DNA聚合酶和饱和荧光染料EvaGreen，EvaGreen PCR预混液可购买商品化的EvaGreen PCR预混液，也可自行配制，本发明中使用商品化的 Bio-Rad SsoFast EvaGreen预混液；阳性对照为金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、沙门氏 菌、副溶血性弧菌和志贺氏菌标准菌株DNA提取液；超纯水可同时作为阴性对照。
[0009] 本发明还涉及五种食源性致病菌五重实时荧光PCR检测方法，包括以下步骤： (1) 提取待测样品DNA ; (2) 取特异性引物和EvaGreen PCR预混液，分别加入阴性对照、阳性对照或待测样品 DNA形成扩增反应体系； 所述步骤（2)的优选扩增体系见表1。
【主权项】
1. 一种食源性致病菌五重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括五对特异 性引物、EvaGreenPCR预混液、阳性对照和超纯水，其中EvaGreenPCR预混液包括PCR缓 冲液、dNTP混合物、DNA聚合酶和饱和荧光染料EvaGreen，阳性对照为金黄色葡萄球菌、单 增李斯特菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌和志贺氏菌标准菌株DNA提取液，所述五对特异性引 物序列如下： nuc上游引物：5'-AACAAGATCGCTATGGTAGAACAITGGC-3'nuc下游引物：5'-CTTCTCTCTAGCAAGTCCCTITTCCACTA-3' hlyA上游引物：5'-AAAAGCAAGTTAGCTCATTTCACATCGT-3' hlyA下游引物：5'-TTACCGITCTCCACCAITCCCAAG-3' invA上游引物：5'-CAATCAGTCCTAACGACGACCCTTC-3' invA下游引物：5'-GCCGCCAAACCTAAAACCAGC-3' tlh上游引物：5'-CGAACGAGAACGCAGACATTACG-3' tlh下游引物：5'-CGGGTTAGGGAAGCGCCAIT-3' ipaH上游引物：5'-GGTAAATCTGCTGTTCAGTCTCACGC-3' ipaH下游引物：5'-ITTACGGACTGGITCTCCCTCTGG-3'。
2. 根据权利要求1所述的一种食源性致病菌五重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，超 纯水同时作为阴性对照。
【专利摘要】本发明提供一种食源性致病菌五重荧光PCR检测试剂盒，主要包括五对特异性引物、EvaGreen PCR预混液、超纯水和阳性对照，特异性引物包括金黄色葡萄球菌的nuc基因、单增李斯特菌的hlyA基因、沙门氏菌的invA基因、副溶血性弧菌的tlh基因和志贺氏菌的ipaH基因的特异性引物。本发明所述试剂盒检测周期短、检测成本低、检测结果可靠。
【IPC分类】C12R1-42, C12Q1-68, C12Q1-04, C12Q1-14, C12R1-445, C12R1-63, C12Q1-10, C12R1-01
【公开号】CN104726594
【申请号】CN201510139899
【发明人】何培彦, 陈中文, 罗建勇, 王恒辉, 燕勇
【申请人】嘉兴市疾病预防控制中心
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年3月27日