检测食源性致病菌的试剂盒及多重荧光pcr检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测食源性致病菌的试剂盒及多重荧光PCR检测方法；该检测方 法结核高分辨率熔解曲线HRM分析和荧光PCR技术，本方法可检测沙门氏菌、金黄色葡萄球 菌、副溶血性弧菌、单增李斯特菌及大肠杆菌〇157:H7五种主要食源性致病菌中的一种或 两种以上至五种食源性致病菌，属于微生物检测领域。
【背景技术】
[0002] 2014年7月1日，国家卫计委发布的强制性食品安全标准"GB29921-2013《食品 中致病菌限量》"正式实施，该标准涉及五种食源性致病菌，即本专利所述沙门氏菌、金黄色 葡萄球菌、副溶血性弧菌、单增李斯特菌以及大肠杆菌0157:H7。
[0003] 其中，沙门氏菌（Salmonella)属肠杆菌科，革兰氏阴性肠道杆菌，已发现的近 一千种。沙门氏菌病除可感染人外，还可感染很多动物，包括哺乳类、鸟、爬行类、鱼、两栖类 及昆虫。人畜感染后可呈无症状带菌状态，也可表现为有临床症状的致死疾病。蛋、家禽和 肉类产品是沙门氏菌病的主要传播媒介，该病受威胁最大的是小孩、老年人及免疫缺陷个 体。根据国际惯例，要求对易受沙门氏菌污染的食品进行分类管理，从而有效预防沙门氏菌 病。
[0004] 副溶血弧菌（VibrioParahemolyticus)，是一种嗜盐性细菌，系弧菌科弧菌属， 革兰染色阴性。进食含有该菌的食物可食物中毒，也称嗜盐菌食物中毒，主要来自海产品。 临床上以急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状。副溶血性弧菌主要来源于鱼、 虾、蟹、贝类和海藻等海产品。本病多在夏秋季发生于沿海地区，常造成集体发病。近年来 由于海鲜空运，内地城市病例也渐增多。
[0005] 金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus)是人类的一种重要病原菌，隶属于葡 萄球菌属，有"嗜肉菌"的别称，是革兰氏阳性菌的代表，可引起许多严重感染。金黄色葡萄 球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。因此，食品受到 污染的机会很多。美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位。金黄 色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生难题。金黄色葡萄球菌的流行病学一般有如下特点：季 节分布，多见于春夏季；中毒食品种类多，如奶、肉、蛋、鱼及其制品。此外，剩饭、油煎蛋、糯 米糕及凉粉等引起的中毒事件也有报道。上呼吸道感染患者鼻腔带菌率83%，所以人畜化 脓性感染部位，常成为污染源。
[0006] 单增李斯特菌是是某些食物（主要是鲜奶产品）中的一种污染物，能引起严重食 物中毒。也是一种人畜共患病的病原菌。感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增 多。它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4°C 的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。
[0007] 荧光PCR检测技术大致分为两大类：荧光探针法（标记荧光PCR)和非标记荧光染 料法。前者则利用荧光标记的特异性探针或者弓I物来识别模板，优点是特异性更高，适用 于扩增序列专一检测，不过检测成本高。后者主要是利用荧光染料与双链DNA分子结合发 光的特性来指示扩增产物的增加，无需另外合成探针，简便易行，成本较低。相对以往普通 非探针标记荧光PCR所用非饱和染料，新型饱和燃料（如LCGreen等）具有以下优点：① 新型饱和染料对PCR反应没有任何抑制作用。②DNA高温变性时，非饱和荧光染料加入则 会造成DNA双链高温变性时，单链部分的荧光染料分子发生迁移，荧光染料分子重新结合 到双链DNA的空置位点，造成荧光信号没有变化，因此出现假阴性，特异性下降，而饱和染 料则不会出现此类情况。③高温稳定，对于高GC含量的PCR产物，在DNA双链高温熔解时， 饱和突光染料结合核酸更稳定。
[0008]目前，食源性致病菌的检测方法主要有传统的培养方法和分子检测方法。其中 传统的培养分离检测方法，依赖于生化和形态学特点，我国以GB4789系列国家食品安全 标准作为经典方法，规范了食源性致病菌传统培养检测方法，分子检测方法则主要为SN/T 1870-2007《食品中致病菌检测方法实时PCR法》。但传统培养法存在操作繁琐、耗时长、易 漏检等缺点。分子检测方法包括了常规PCR方法和探针法荧光PCR方法，常规PCR需要扩 增后进行电泳，操作复杂且易引起污染。而探针法PCR则存在检测成本很高，试剂保存期短 等缺点。
[0009] 研究人员对此已开展了许多方法研究，但是同时针对这五种食源性致病菌开展多 重荧光PCR检测的研究尚未见报道
【发明内容】
[0010] 本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种操作简便、快速，成本 低的检测食源性致病菌的试剂盒；
[0011] 本发明另一个目的是提供一种采用上述试剂盒的多重荧光PCR检测主要食源性 致病菌的方法，而且检测结果准确。
[0012] 为了达到上述目的，本发明采用以下方案：
[0013] 一种检测食源性致病菌的试剂盒，其特征在于由以下组分组成：
[0014]
【主权项】
1. 一种检测食源性致病菌的试剂盒，其特征在于由以下组分组成： HRM反应预混液 10 μ L(终浓度I X ) dNTPs混合液 2.0 μ L(终浓度0.2 mM) Taq聚合酶 0 5 μ L(终浓度0.1 U/ μ L) 上游引物 0.5 wL01^j.i〇.5pmol/L) 下游引物 0.5 uL(终浓度0 5pmol/L) 荧光染料 1 μL(终浓度IX) DNA模版 I UL 水 2 5 μ L 。
2. 根据权利要求1所述的一种检测食源性致病菌的试剂盒，其特征在于所述的上游引 物包括沙门氏菌目的基因16 s RNA上游引物SLMF : 5 ' -GGTGAAGGAITTAACCGTGAACTT-3 ' ； 所述下游引物包括沙门氏菌目的基因16s RNA上游引物SLMR: 5 '-GCGCCTCGTTATCATCCAAAT-3'。
3. 根据权利要求2所述的一种检测食源性致病菌的试剂盒，其特征在于所述上游引物 还包括金黄色葡萄球菌的目的基因16s RNA上游引物SPAF :5 '-CCTAATCAGAAAGCCACG-3'， 所述下游引物还包括黄色葡萄球菌的目的基因16s RNA下游引物SPAR : 5 '-AGTTTCCAATGACCCTCC-3'。
4. 根据权利要求2或3所述的一种检测食源性致病菌的试剂盒，其特征在于所述上游 弓丨物还包括副溶血性弧菌目的基因 TLH上游引物VPF : 5 ' CAAACCAGCAAACACCTT-3 ';所述下 游引物还包括副溶血性弧菌目的基因 TLH下游引物VPR : 5 'GTCCGTCAAACGAATCAG-3 '。
5. 根据权利要求4所述的一种检测食源性致病菌的试剂盒，其特征在于所述上游引 物还包括单增李斯特菌目的基因16s RNA上游引物LMOF :5 '-ATCTAACCAGAAAGCCACG-3'， 所述下游引物还包括单增李斯特菌目的基因16s RNA下游引物LMOR : 5 '-GTTCCTCCACATATCTACGC-3'。
6. 根据权利要求5所述的一种检测食源性致病菌的试剂盒，其特征在于所述上游引物 还包括大肠杆菌〇157:H7目的基因 rfbE上游引物0157F :5 '-GCTTTGTTAGCGTTAGGT-3'， 所述下游引物还包括大肠杆菌〇157:H7目的基因 rfbE下游引物0157R : 5 '-GACATTTGCCAAGTTTCA-3'。
7. -种多重荧光PCR检测方法，其特征在于包括以下步骤： A、 根据食源性致病菌设计引物对； B、 提取样本DNA后，利用设计的引物对进行荧光PCR扩增； C、 应用带HRM模块的荧光定量PCR仪对PCR扩增产物进行HRM分析，确定扩增产物Tm 值； 其中步骤B中进行非标记荧光PCR扩增过程中的反应液由以下组分组成： HRM反应预混液 10 μLχ终浓度I X) dNTPs混合液 2.0 μLχ终浓度0.2 mM) Taq聚合酶 0.5 μLχ终浓度0.1 1%L) 上游引物 0.5 μL(终浓度0.5 pmo丨/L) 下游引物 0.5 pL(终浓度0.5 pmol/L) 荧光染料 IpL(终浓度IX) DNA模板 I gL 水 2.5 μΕ 〇
8. 根据权利要求7所述的一种多重荧光PCR检测方法，其特征在于步骤B中对所有致 病菌检测时PCR扩增的反应程序按以下步骤进行： (1) 92°C ~96°C预变性 30s ; (2) 92°C ~96°C变性 10 ~30s，55°C -63°C退火 10 ~30s，72°C 10 ~30s，共进行 40 ~ 50个循环； (3) 72°C延伸 10 ~30s。
9. 根据权利要求7或8所述的一种多重荧光PCR检测方法，其特征在于步骤C中对PCR 扩增产物进行HRM分析，按以下步骤进行： (1) 92°C~96°C变性 Imin ; (2) 40°C复性 Imin ; (3) 初始熔解温度60°C~65°C，开始程序升温熔解至95°C，并在熔解过程中实时检测 突光信号，15~25次/秒。
10. 根据权利要求9所述的一种多重荧光PCR检测方法，其特征在于所述荧光染料为 Eva Green染料、LC Green? PLUS染料、SYT09染料中的一种或者两者以上的混合物；所述 dNTP 混合液为由各 2. 5mM 的 dATP、dCTP、dTTP、dGTP 组成。
【专利摘要】本发明新型公开了一种检测食源性致病菌的试剂盒及多重荧光PCR检测方法；该检测食源性致病菌的试剂盒，其特征在于由以下组分组成：HRM反应预混液；dNTPs混合液；Taq聚合酶；上游引物；下游引物；荧光染料；DNA模版；水。本发明一种多重荧光PCR检测方法，其特征在于包括以下步骤：提取样品DNA；对样品DNA进行多重荧光PCR扩增，扩增后对产物进行HRM分析后判定结果。本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种操作简便、快速，成本低的检测食源性致病菌的试剂盒；本发明另一个目的是提供一种采用上述试剂盒的多重荧光PCR检测主要食源性致病菌的方法，而且检测结果准确。
【IPC分类】C12Q1-68, C12Q1-14, C12Q1-04, C12Q1-10
【公开号】CN104651487
【申请号】CN201410621337
【发明人】蔡先全, 李蓉, 邱德义, 鱼海琼, 柏建山, 岳巧云, 赵美转, 萧绮倩, 张磊
【申请人】蔡先全
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2014年11月5日