专利名称：食源性致病菌快速检测基因芯片及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于检测技术领域，涉及一种基因芯片(或称DNA微阵列)，尤其是一种食源性致病菌快速检测基因芯片。
背景技术：
“民以食为天”。食品与人类的生存和健康密切相关。保证食品的安全卫生、防止有毒有害物质通过食品对人体造成危害是至关重要的。食品在生产、加工、贮存、运输和销售等各个环节都有可能受到环境中各种因素的影响和污染，微生物污染尤为常见。食品由于受致病菌的污染，造成各种食源性疾病，甚至死亡。为了判断食品是否安全，预防和控制食源性传染病的传播以及快速诊断细菌性食物中毒，必须要有一种能够快速、准确、及时、高效且能自动化的检测致病菌的方法。
传统的检测方法存在以下两方面的不足一是操作烦琐、费时费力；二是在检测结果上易出现假阳性或假阴性结果，不易进行质量控制。随着免疫学和分子生物学技术的发展，免疫荧光技术、单克隆抗体技术、生物传感器技术、基因探针技术和PCR等技术已被用于致病菌的检测。这些技术灵敏度较高、特异性强，在微生物检测方面具有较好的应用前景。然而，这些检测技术一次实验一般只能检测一种微生物，而食品中存在的致病菌种类很多，所以尚不能满足实际检测工作的需要。
基因芯片技术是九十年代建立的一种全新的分析检测技术，是随着人类基因组计划的开展而逐步发展起来的。该技术综合运用了分子生物学技术、集成电路制造技术、计算机技术、半导体技术、共聚焦激光扫描技术、荧光标记技术，使样品的检测具有敏感性高、特异性强、大规模集成化、自动化、操作简便、快速，高效率等优点。目前，基因芯片技术主要应用于基因表达相关研究和生物制药研究等方面。利用基因芯片技术实现对多种常见致病菌的快速检测鉴定还是一个崭新的科研领域。
发明内容
本发明的内容之一是提供一种用于快速检测食源性致病菌的基因芯片，这种基因芯片克服了现有技术的不足，能够快速、准确、高效地检测和鉴定食品中致病菌的种类。
本发明的内容之二是提供这种基因芯片的制备方法并提供26条用于检测的寡核苷酸探针序列。
本发明的内容之三是提供这种基因芯片在食源性致病菌快速检测中的应用。
具体实施例方式
本发明的内容之一是这样实现的通过生物信息学手段，设计一系列针对不同致病菌的检测探针，将探针按照一定排布方式点样在醛基化的显微镜载玻片表面或者其他固相载体表面，制备成基因芯片。待检样品通过PCR反应标记上荧光，PCR产物不需要纯化直接与基因芯片在适当温度下杂交1h以上，利用生物芯片扫描仪检测荧光信号，根据荧光信号出现的位置即可判断致病菌的种类。对于分离的未知菌落，整个检测过程可以在3h之内完成。这种基因芯片能够检测的细菌种类有金黄色葡萄球菌、志贺菌、沙门菌、大肠杆菌O157、变形杆菌、单核增生李氏菌、小肠结肠炎耶氏菌、铜绿假单胞菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、腊样芽胞杆菌、乙型溶血性链球菌、椰酵假单胞菌、肉毒梭菌、空肠弯曲菌、河弧菌、产气荚膜梭菌等。
本发明的内容之二是这样实现的利用Oligo 6.0等生物信息学软件和GenBank等公共序列数据库，设计和筛选用于检测细菌16S rRNA基因变异的寡核苷酸探针，并且设计了检测部分细菌致病基因的寡核苷酸探针。寡核苷酸合成时进行了3’端氨基化修饰或者5’端氨基化修饰。
基因芯片的载体选用显微镜载玻片。所用载玻片需要进行表面氨基化和醛基化处理。
利用自动点样仪或者手动点样仪完成全部点样，制成基因芯片，芯片上点阵的排布方式根据需要设定。利用硼氢化钠等封闭芯片上未与寡核苷酸结合的醛基。
基因芯片作为一种技术平台，其作用是依赖芯片上所固定的探针来实现的。本发明基因芯片上固定的探针及其检测作用如表1所示。
表1“食源性致病菌快速检测基因芯片”上固定的探针及其检测作用序号 序列(5′-3′) 检测对象与用途1gtacaaggcccgggaacgtattcaccg 与所有真细菌杂交，用于检测所有真细菌2gacataaggggcatgatgatttgacgtc与革兰氏染色阳性细菌杂交，用于检测革兰氏阳性细菌3gtcgtaagggccatgatgacttgacgtc与革兰氏染色阴性细菌杂交，用于检测革兰氏阴性细菌4gtcatgaatcacaaagtggtaagcgcc 与肠道细菌杂交，用于检测肠道细菌5acgacgcactttatgaggtccgcttg 与大肠杆菌、沙门菌、志贺菌杂交，用于检测这三属细菌6gctcctaaaaggttactccaccggctt 用于检测金黄色葡萄球菌的探针7cgacggctagctccaaatggttact 用于血浆凝固酶阴性葡萄球菌探针8cggctagctccaaaaggttactcta 用于血浆凝固酶阴性葡萄球菌探针9tcacggtcttgcgtcttattgtacctac用于检测肉毒梭状芽孢杆菌的探针10 tagataatcggcttcgggcgtctccaac用于检测艰难梭菌的探针11 gaactgagactggtttttaagtttggct用于检测产气荚膜梭菌的探针12 ccctagagcataaggggcatgatgattt用于检测破伤风梭菌的探针13 tcacggtcttgcgtcttattgtacctac检测志贺菌virA基因的探针14 tagataatcggcttcgggcgtctccaac检测沙门菌invA基因的探针15 cgaactgggacatattttatagatttgc用于检测空肠弯曲菌的探针16 ggtcgccccttcgccgccctctgtatca用于检测椰酵假单胞菌的探针17 cgatccaccctgagaccggcttttaagg用于检测腊样芽胞杆菌的探针18 tactcgtaagggccatgatacgacttaa用于检测普通变形杆菌的探针19 cgcggcttggcaaccctttgtaccgacc用于检测铜绿假胞菌的探针20 actgagaatagttttatgggattag 用于检测单核增生李斯特氏菌的探针21 gctccaccttcgcggtattcgctgccct用于检测霍乱弧菌的探针22 tcactttcgcaagttggccgccctctgt用于检测河弧菌的探针23 tggtaagcgtccccccgtagttgaaac 用于检测副溶血性弧菌的探针24 tacgacagactttatgtggtccgcttgc用于检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的探针25 agattggctttaagagattagcttgccg用于检测乙型溶血性链球菌的探针26 atccccaccttcctccagtt作为实验阳性对照的探针本发明的内容之三是这样实现的这种基因芯片可以用于食品中常见致病菌的快速检测鉴定、引起食物中毒致病菌检测鉴定、食品安全性评价等方面。检测时，将待检细菌进行PCR扩增，扩增用引物的序列如表2所示。为了对PCR产物进行荧光标记，一种做法是将引物1169U20进行荧光标记，另一种做法是利用带有荧光标记的碱基如Cy3-dCTP或Cy5-dUTP等按一定比例掺入PCR反应体系，这两种荧光方法的标记效果是近似的。
表2引物序列引物名称 序列(5′-3′)1169U20AACTGGAGGAAGGTGGGGAT1521L19AGGAGGTGATCCAACCGCAPCR扩增产物经过变性与杂交液混合，加至基因芯片探针阵列之上，并保持在45℃-60℃杂交1h以上。配制洗涤液，待杂交完毕，按照离子强度由高到低的顺序对基因芯片进行洗涤。用生物芯片专用扫描仪读取芯片上的荧光信号，并利用相应的生物芯片数据分析软件分析得到的扫描结果，判定样品细菌的种类，达到对致病菌检测鉴定的目的。
由上述公开的技术方案可见，这种基因芯片可以对多种致病菌进行检测，大大缩短了检测时间、提高了检测的准确性又降低了成本，将会具有深远的意义。
实施例为进一步说明食源性致病菌快速检测基因芯片及其用途，参照下列实施例进行说明，这些实施例是为了解释而不是以任何方式限制本发明。
实施例一食源性致病菌快速检测基因芯片的制备1.1载体玻璃片的表面醛基化处理显微镜载玻片用铬酸洗液浸泡过夜，以去除表面有机物等杂质，然后用蒸馏水清洗，并浸入25％氨水中过夜。之后，将载玻片浸入含氨丙基三甲氧基硅烷的95％乙醇(pH至4.5)中20min，用95％乙醇超声清洗30min，纯水超声清洗20min，115℃烘干45min。最后将载玻片浸泡在5％的戊二醛溶液中浸泡50min，接着超声清洗10min，水洗2次，置于干燥隔尘处备用。
1.2利用自动点样仪在载玻片上点涂探针阵列生物芯片点样仪(Cartesian Technologies)的机械手的型号为AxSys 5000，使用的控制软件为PixSys 5500Workstation。使用一支羽毛笔式点样针头完成全部点样。点之间间距为0.5mm。阵列中探针(序号)的排布如表3所示在点样仪的移动台上放置好经过表面处理的醛基载玻片。
取每个探针溶液4μl，依次加入一崭新的96孔板的相应孔中。然后向每孔加入4μl 6×SSC，反复吹打混匀。将96孔板安放在点样仪的样品台上。启动PixSys 5500 Workstation，设置好各个参数，开始点样。机器手控制针头，每点一个样品要经过上样、清洗、干燥几个过程。
点样完毕后，芯片在室温下自然干燥24h，含有点阵的区域用铅笔在背面标记。点好的芯片放在清洁的玻片盒中，在阴凉干燥处保存。
表3阵列中探针的排布12 3 4 5 6
ABCDE1.3封闭为了封闭玻片上未与寡核苷酸结合的醛基，祛除盐类和未结合的寡核苷酸，按照以下程序对玻片进行处理0.2％SDS(25℃)洗2次，每次5min；纯水(25℃)洗2次，每次5min；纯水(95℃)洗1次，洗2min，凉至室温；迅速将玻片放入封闭液洗5min；(使用的封闭液的配方是将1.3g NaHB4溶在375ml PBS溶液中，再向溶液加入125ml无水乙醇，立即使用。)0.2％SDS(25℃)洗3次，每次1min；纯水(25℃)洗2次，每次1min；玻片自然干燥，尽快使用。
实施例二本发明检测未知细菌的应用举例2.1挑取一环生长在培养基上的菌落，研磨混匀于100μl纯水中，，煮沸10min，10000rpm离心1min，吸取上清2μl加入PCR反应混合液中。PCR反应混合液配方如表4。
表4PCR反应混合液配方成份 浓度 加样量(μl)ddH20 - 37.310×PCR Buffer(Mg2+Plus)10× 5.0dNTP Mixture 2.5mmol/L 4.01169U20(Cy3标记) 5μmol/L 1.01521L19 5μmol/L 0.5TaKaRa Taq(5U/ml)5U/μl 0.2
2.2将反应管放入PCR仪(PE 2400)中，设定循环参数循环参数94℃，5min；94℃，25sec；55℃，25sec；72℃，25sec；，共40个循环；72℃，5min；100℃，5min；4℃，5min。
PCR反应结束立即取出反应管进行下一步杂交反应。
2.3取扩增产物(4℃)1μl与4μl杂交液(Telechem公司)混合，点在“食源性致病菌快速检测基因芯片”(制备方案见实施例一)探针阵列区域，小心地盖上盖玻片膜，注意盖玻片与载玻片之间不可留有气泡。放入杂交盒，向盒内加入10ml 3×SSC以保持湿度。拧紧杂交盒的螺丝，放入55℃水浴锅内杂交1h。取出杂交盒，拿出玻片，立即投入洗涤液A(55℃)洗60sec，再投入洗涤液B(25℃)洗60sec，洗涤液C(25℃)洗60sec。去除残留的液体并在空气中干燥。
洗涤液的配方是洗涤液A1×SSC(0.2％SDS)洗涤液B0.1×SSC 0.2％SDS)洗涤液C0.1×SSC2.4杂交结果扫读分析用ScanArray 3000生物芯片扫描仪扫读基因芯片，选用绿色激光，设定激光强度为80％，光电倍增管增益值为80％，扫描分辨率为10μm。扫描结果存为TIFF格式的文件。启动Imagene4.0软件对结果进行分析。
根据荧光信号出现的位置和强度即可判别样品菌的种类。
权利要求
1.一种食源性致病菌的快速检测基因芯片，这种基因芯片由载体和固定在载体表面的多条寡核苷酸探针构成。其特征在于载体表面的多条寡核苷酸探针按照一定方式排布，通过与待检样品的杂交反应，可以检测鉴定样品细菌的种类。
2.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，寡核苷酸探针固定在玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等固相载体上，形成n×n的阵列，每一阵列具有阳性对照探针。可以有多个这样的阵列分布于同一个固相载体上。将探针涂布到固相载体的途径是机械手打印、喷印或者手工点样，这样制备好的探针阵列就是基因芯片(或称DNA微阵列)。
3.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，寡核苷酸探针的设计以细菌的16S rRNA基因为依据，旨在检测不同细菌16S rRNA基因序列上的变异，从而区分细菌的种属。探针根据功能分为五类A.所有真细菌共有探针；B.区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的探针；C.科特异性探针；D.属/种特异性探针E.阳性对照探针和阴性对照探针为了对近源细菌更好地区分，本发明同时提供了针对部分细菌致病基因的检测探针。包括检测志贺菌virA基因的探针、针对沙门菌invA基因的探针等。
4.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，探针的序列设计在16s rRNA基因的可变区，长度为20-29个碱基不等。每条探针的碱基序列可以与16s rRNA基因上特定区域DNA正链的碱基序列一致，也可以与16s rRNA基因上这一特定区域DNA负链的碱基序列一致。同一次杂交反应中使用的所有探针上述一致性相同。
5.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，以每条探针的碱基序列与16s rRNA基因上特定区域DNA负链的碱基序列一致为准，本发明的整套探针的序列(5′-3′)及其可以达到的检测功能是1 gtacaaggcccgggaacgtattcaccg 与所有真细菌杂交，用于检测所有真细菌2 gacataaggggcatgatgatttgacgtc与革兰氏染色阳性细菌杂交，用于检测革兰氏阳性细菌3 gtcgtaagggccatgatgacttgacgtc与革兰氏染色阴性细菌杂交，用于检测革兰氏阴性细菌4 gtcatgaatcacaaagtggtaagcgcc 与肠道细菌杂交，用于检测肠道细菌5 acgacgcactttatgaggtccgcttg 与大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌杂交，用于检测这三属细菌6 gctcctaaaaggttactccaccggctt 用于检测金黄色葡萄球菌的探针7 cgacggctagctccaaatggttact 用于血浆凝固酶阴性葡萄球菌探针8 cggctagctccaaaaggttactcta 用于血浆凝固酶阴性葡萄球菌探针9 tcacggtcttgcgtcttattgtacctac用于检测肉毒梭状芽孢杆菌的探针10 tagataatcggcttcgggcgtctccaac用于检测艰难梭菌的探针11 gaactgagactggtttttaagtttggct用于检测产气荚膜梭菌的探针12 ccctagagcataaggggcatgatgattt用于检测破伤风梭菌的探针13 tcacggtcttgcgtcttattgtacctac检测志贺菌virA基因的探针14 tagataatcggcttcgggcgtctccaac检测沙门菌invA基因的探针15 cgaactgggacatattttatagatttgc用于检测空肠弯曲菌的探针16 ggtcgccccttcgccgccctctgtatca用于检测椰酵假单胞菌的探针17 cgatccaccctgagaccggcttttaagg用于检测腊样芽胞杆菌的探针18 tactcgtaagggccatgatacgacttaa用于检测普通变形杆菌的探针19 cgcggcttggcaaccctttgtaccgacc用于检测铜绿假胞菌的探针20 actgagaatagttttatgggattag 用于检测单核增生李斯特氏菌的探针21 gctccaccttcgcggtattcgctgccct用于检测霍乱弧菌的探针22 tcactttcgcaagttggccgccctctgt用于检测河弧菌的探针23 tggtaagcgtccccccgtagttgaaac 用于检测副溶血性弧菌的探针24 tacgacagactttatgtggtccgcttgc用于检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的探针25 agattggctttaagagattagcttgccg用于检测乙型溶血性链球菌的探针26 atccccaccttcctccagtt作为实验阳性对照的探针
6.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，探针为寡核苷酸探针，探针的3’端或者5’端经过了氨基化修饰。
7.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，利用两条通用引物扩增几乎所有细菌的16S rRNA基因约370bp长的片段(针对不同细菌，产物片段长度有所不同)，作为下一步基因芯片检测的靶序列。两条引物的序列(5′-3′)如下1169U20AACTGGAGGAAGGTGGGGAT1521L19AGGAGGTGATCCAACCGCA其中一条引物经过5’端荧光素标记。利用上述的引物进行PCR扩增，扩增产物不需要纯化，在一定的杂交反应条件下与基因芯片共保温20min至数小时，利用荧光扫描仪即可检测到荧光信号。根据信号出现的位置可以判断出细菌的种类。
8.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，这种基因芯片能够准确检出金黄色葡萄球菌、志贺菌、沙门菌、大肠杆菌O157、变形杆菌、单核增生李氏菌、小肠结肠炎耶氏菌、铜绿假单胞菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、腊样芽胞杆菌、乙型溶血性链球菌、椰酵假单胞菌、肉毒梭菌、空肠弯曲菌、河弧菌、产气荚膜梭菌等。
9.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，利用上述的整套探针或其中一部分，可以通过杂交反应对实验样品中的相应细菌进行检测。具有较高的灵敏度和特异度，尤其适用于基于基因芯片原理的检测。
10.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，这种基因芯片克服了现有技术的不足，能够快速、准确、高效地检测和鉴定食品中致病菌的种类。可以用于食品的监督与检测、食物中毒病源菌检测、细菌学分类与流行病学调查等领域。
全文摘要
本发明提供一种用于快速检测食源性致病菌的基因芯片，公开了这种基因芯片的制备方法并提供26条用于检测的寡核苷酸探针序列。这种基因芯片克服了现有技术的不足，能够快速、准确、高效地检测、鉴定食品中致病菌的种类。检测范围包括金黄色葡萄球菌、志贺菌、沙门菌、大肠杆菌O157、变形杆菌、单核增生李氏菌、小肠结肠炎耶氏菌、铜绿假单胞菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、腊样芽胞杆菌、乙型溶血性链球菌、椰酵假单胞菌、肉毒梭菌、空肠弯曲菌、河弧菌、产气荚膜梭菌等。本发明可以用于食品的监督与检测、食物中毒病源菌检测、细菌学分类与流行病学调查等领域，具有深远的社会效益与较大的经济效益。
文档编号C12Q1/68GK1536090SQ03109149
公开日2004年10月13日 申请日期2003年4月7日 优先权日2003年4月7日
发明者李君文, 靳连群, 王新为, 晁福寰, 王升启 申请人:中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所, 中国人民解放军军事医学科学院卫生学