专利名称：食源性致病菌分子检测标记的建立方法
技术领域：
本发明涉及一种食源性致病菌分子检测标记的建立方法。
背景技术：
食源性致病菌是引起食物中毒，危害人类健康的重要微生物，无论在发达国家还是 发展中国家，都是影响食品安全的最主要原因，其中金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特、 沙门氏杆菌和副溶血弧菌等是国际公认的危害广泛的四大致病微生物。近年来全球多个 国家多次爆发由上述致病菌引起的食源性疾病。金黄色葡萄球菌(5Ya/7/y^^o"^ s"re"s)是引起人类感染和细菌性食物中毒的一种重要致病菌，由它引起的食物中毒发 生频率极高。在我国由金黄色葡萄球菌引起的中毒病例占食物中毒总数的20% 25%，是 仅次于沙门氏菌和副溶血性弧菌的第三大致病菌。据国外疾病控制中心报道，在美国由 金黄色葡萄球菌引起的食物中毒居第二位，占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则高 达45 %。据报道，我国细菌性食物中毒中70 % 80 %是由沙门氏菌引起的。
目前，食源性病原微生物快速检测的方法是基于核酸的分子生物学的方法，主要有 核酸探针法和聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)法。PCR检测方法存 在着检测准确性高(105Cfu/mL)和检测时间短(8h)等优势，其准确度主要取决于使用 的检测标记的特异性。目前已报道的食源性致病菌分子检测标记有几十多种，这包括金 黄色葡萄球菌肠毒素基因(eWA、 e/ ffi、 e"rt:i、 e/7rf)和e"tE)、耐热核酸酶基因(/wc)、 表皮剥脱毒素(ete和"扮基因和中毒性休克综合症毒素基因(t")、耐甲氧西林基因 (7Z ecA和/eM)、 16S-23S rRNA、沙门氏菌的i/7yA、 i/ W、 j'; pC、 i/ ④、i/ ^、 / WA、 fiM、 r/S、 ag/A、 w'aB、 5"尸K、单核增生李斯特菌的/ 7yA、 iap、 Y/l/A、 j'/77B、 priA、 WcA、 aZcB、卿厶志贺氏菌的&7和w'/A、副溶血性弧菌的t必、tr力和肠出血性大肠 埃希氏菌的Wy、 s"、朋連因等。但是越来越多的研究表明，现有的致病菌的检测标 记都是通过比较繁琐和较长时间的研究工作而获得的，其数量少、特异性低，而且利用 己有的分子检测标记建立的检测方法在实际检测出现了假阳性和假阴性的错误结果，这 就要求人们建立一种新的分子检测标记的发掘方法，以便发掘特异性更高的分子检测标 记，以解决食源性致病菌分子检测方法的不足。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的食源性致病菌分子检测标记特异性不高、 检测方法存在误检等问题而提供一种食源性致病菌分子检测标记的建立方法。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案
一种食源性致病菌分子检测标记的建立方法，其特征在于该方法的具体步骤为
a. 收集一种食源性致病菌的所有基因组序列；
b. 选取步骤a中获得的基因组序列中的任一基因组切分成长度为500 1000bp的片 段，将每个切分片段与其余的基因组序列进行比对，保留相似性达到98%以上的 切分片段，得到保守序列片段；
c. 将步骤b获得的保守序列片段中的任一片段与其他微生物基因组序列进行比对， 剔除保守序列片段中与其他微生物基因组序列相同的片段，则保留下来的序列片 段即为该食源性致病菌的特异性标记群；
d. 将步骤c获得的特异性标记群中的数据信息进行筛选，得到食源性致病菌分子检 测标记。
与现有技术相比，本发明的方法具有如下显而易见的突出特点和显著优点
1、 本发明首次提出了利用生物信息学和微生物基因组学相结合发掘食源性致病菌 分子检测标记的方法。
2、 本发明方法获得的食源性致病菌分子检测标记的特异性比现有的分子检测标记 的特异性要高。
3、 本发明不需要进行分子克隆、基因测序、PCR等分子生物学实验，可以节约财力。
4、 本发明获得的分子检测标记数量大，可以进一步深入研究和利用。
5、 本发明获得分子检测标记能够满足生物芯片对检测标记的要求。
6、 本发明方法同样适合于其他微生物的分子检测标记的发掘。
图1本发明方法的实施例流程图
具体实施例方式
下面以金黄色葡萄球菌分子检测标记的建立方法为具体实施例，进一步阐述本发 明。应理解，本实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在 阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价 形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例一 具体步骤如下
(1) 金黄色葡萄球菌与对比菌株基因序列的收集；从GenBank (ftp://ftp.ncbi.nih.gov/genbank/genomes/Bacteria/)收集所有已经公布14株金
黄色葡萄球菌基因组序列(5Y邵/u^ococc"s a"re"s NCTC 8325、 USA300、 RF122、 C0L、 Mu50、 N315、 MRSA252、 JH1、 JH9、 MSSA476和MW2)及其他所有完成测序的微生物基因 组序列。
(2) 分析获得金黄色葡萄球菌保守序列片段将5Y邵/^ococmsa"re"sATCCN315 基因组按照500bp的长度进行切分，将每个切分片段和其他金黄色葡萄球菌的基因组利 用BLASTN进行逐一比对分析，保留相似性达到98%以上的序列片段。
(3) 食源性致病菌种特异性的核酸序列片段群的获得将上述获得的金黄色葡萄 球菌核酸保守片段中任一片段和其他微生物与病毒的基因组序列进行比对分析，剔除其 中与其他微生物基因组片段相同的片段，经过筛选保留下来的1371个核酸序列片段就 是金黄色葡萄球菌特异性标记群。
(4) 食源性致病菌分子检测标记的获得基于(3)所获得特异性检测标记群中的 数据信息，结合引物设计、PCR反应条件等生物学原理，筛选适合于进行分子生物学检 测的序列片段作为检测标记，列举其中4个作为代表，结果见序列表序列表
〈110〉上海大学
〈120〉食源性致病菌分子检测标记的建立方法
〈160〉 4
〈210〉 1
<211> 500
<212〉 DNA
〈213〉 金黄色葡萄球菌(5"帥/ /iococctw 3"re〃51)
〈400〉 1
aaatgatgat aaagtgaatc aagtatgcga ctatatcgag ttacattttc atgaagattt 60
aagcctttca gaattaagcg aatacgttgg gtggtcagag agccatctgt ctaaaaagtt 120
tacagaatcg ctaggtgtag gattccaaca tttcttaaat acgacgcgaa ttgagcatgc 180
gaaactcgat ttaacataca cagatgaaac gattactgat attgcattgc aaaatggctt 240
ttcaagtgca gcgagctttg cgagaacatt taaacacttt acgcatcaaa cgcctaaaca 300
atatcgaggt gatcgtccag caatcactga aaatcaacaa tcggcacaac ataattatca 360 cgaccgtgaa ttgatattac ttttaaatga ctacattgaa gaaatgaatc atttcattga 420 agatattgaa aagatgaact ataaagagat tgcctttaaa ccaactaatc aacaactaaa 480 tcaatttaat catattattc 500
〈210〉 1
〈211〉 500
<212> DNA
<213〉 金黄色葡萄球菌(5Y3p/ y/ococctw sorei/s)
〈400> 2
aagtgggcta tttgaggaat ttgctcaata cacagtatca atcacagttg cttacatgtc 60
atcatgattt tcaagtcaat gaagtattag catatgatgt gatgccatat attatgaaaa 120
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〈210〉 1 〈211〉 500 〈212〉 DNA〈213〉 金黄色葡萄球菌(5"帥/ j^c^cc〃5" s"reiAS)
〈400> 3
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attaataaaa cgaattacct tatcgactta atgcatcgcc ataacctaaa gcgtccactc 120
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gacaatcaaa tgaatatgcg 500
〈210〉 1
〈211〉 500
〈212〉 DNA
〈213〉 金黄色葡萄球菌(5Yap力y7ococc〃s 3"_raAs)
〈400〉 4
tgcaacggaa atgatccatt tgaacattaa tgccctagaa gacggtatgt ataagattaa 60
acattttacc ttagataaag aaaatggtgc gttatttaat ctttggcgca aacatcatac 120
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tgggattcac ttaattgaag taaaacgtta cccaagttca taaaatgatc acaaatcaca 300
aattttgata tacataattt gtgatttttt atattcaaag ctaaaattgc aaaaaattaa 360
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ggagatgaag gatatgaatc aacaattaat tgaagcttta aaatctaaag aagacaaaat 480
gattgagatc agacgttatt 500
权利要求
1、一种食源性致病菌分子检测标记的建立方法，其特征在于该方法的具体步骤为a.收集一种食源性致病菌的所有基因组序列；b.选取步骤a中获得的基因组序列中的任一基因组切分成长度为500～1000bp的片段，将每个切分片段与其余的基因组序列进行比对，保留相似性达到98％以上的切分片段，得到保守序列片段；c.将步骤b获得的保守序列片段中的任一片段与其他微生物基因组序列进行比对，剔除保守序列片段中与其他微生物基因组序列相同的片段，则保留下来的序列片段即为该食源性致病菌的特异性标记群；d.将步骤c获得的特异性标记群中的数据信息进行筛选，得到食源性致病菌分子检测标记。
2、 根据权利要求1所述的食源性致病菌分子检测标记的建立方法，其特征在于所述的食源 性致病菌是指经食品引起人类患病的细菌、真菌、病毒或类病毒。
3、 根据权利要求1或2所述的食源性致病菌分子检测标记的建立方法，其特征在于所述的 食源性致病菌为金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特、沙门氏杆菌、副溶血弧菌、耐热核 酸酶基因、表皮剥脱毒素基因、中毒性休克综合症毒素基因、耐甲氧西林基因、16S-23S rRNA或肠出血性大肠埃希氏菌的hly,slt、 eae基因。
4、 根据权利要求1所述的食源性致病菌分子检测标记的建立方法，其特征在于所述的食源 性致病菌的所有基因组序列是从DDBJ、 EMBL、 NCBI以及TIGR的数据库中获得。
5、 根据权利要求1所述的食源性致病菌分子检测标记的建立方法，其特征在于基因组序列 进行比对采用的比对软件为BLAST。
全文摘要
本发明涉及一种食源性致病菌分子检测标记的建立方法。该方法的具体步骤为收集一种食源性致病菌的所有基因组序列；选取基因组序列中的任一基因组切分成长度为500～1000bp的片段，将每个切分片段与该种食源性致病菌其他的基因组序列进行比对，保留相似性达到98％以上的切分片段，得到该种食源性致病菌保守序列片段；将保守序列片段中的任一片段与其他微生物基因组序列进行比对，剔除保守序列片段中与其他微生物基因组序列相同的片段，则保留下来的序列片段即为该种食源性致病菌的特异性标记群；将特异性标记群中的数据信息进行筛选，得到该食源性致病菌分子检测标记。本发明首次提出了利用生物信息学和微生物基因组学相结合发掘食源性致病菌分子检测标记的方法，所得到的检测标记的特异性比现有的分子检测标记的特异性要高，且本发明不需要进行分子克隆、基因测序、PCR等分子生物学实验，可以节约财力。
文档编号C12Q1/04GK101343662SQ20081003239
公开日2009年1月14日 申请日期2008年1月8日 优先权日2008年1月8日
发明者刘战民, 尹京苑 申请人:上海大学