本发明属于分子遗传育种技术领域，具体涉及梨果心大小主效qtl位点的分子标记marker37152及其引物对和应用。
背景技术：
梨(pyrusl.)是我国重要的经济作物，面积和产量均居世界首位。梨果心大小是梨果实品质重要的经济性状，直接关系到果实可食率的大小。小果心是育种工作者重要的育种目标之一。
梨为多年生木本植物，世代周期长，结果晚。传统育种中，主要利用果实表型进行优良基因的选择，需要经过童期后方能进行观察，且易受到外界环境的影响，育种手段存在耗时长、消耗大、随机性强的问题。以分子标记为主要手段的基因型选择技术可有效解决以上问题。而以构建杂交群体进行连锁作图并定位果心大小性状qtl(quantitativetraitloci，数量性状基因座)是目前开发与果心大小qtl紧密连锁分子标记的主要方法。通过此方法获得的与果心大小紧密连锁的分子标记可用于分子标记辅助育种，并在苗期进行目标性状的提前选择。
目前，国内外仍未见梨果心大小性状的qtl定位报道。因此，开展梨果心大小主效qtl的定位，并开发相连锁的分子标记，建立分子标记辅助育种体系可在苗期进行果心大小的鉴定，能有效提高该性状的育种效率。
技术实现要素：
本发明目的是提供一种梨果心大小主效qtl位点fcs的分子标记marker37152及其引物对。
本发明另一目的是提供分子标记marker37152的引物对在检测与梨果心大小主效qtl位点连锁的分子标记marker37152的方法。
本发明又一目的是提供分子标记marker37152用于检测梨果心大小的方法。
本发明又一目的是提供分子标记marker37152的引物对在梨分子育种中的应用。
本发明再一目的是提供分子标记marker37152在梨分子育种中的应用。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供一种梨果心大小主效qtl位点的分子标记marker37152的引物对，所述引物对的正向引物序列如seqidno:1所示，反向引物序列如seqidno:2所示。
本发明还提供了一种梨果心大小主效qtl位点的分子标记marker37152，所述分子标记marker37152位于登录号为ajsu00000000.1的‘砀山酥梨’基因组scaaffold468.0的第180673～180849碱基处；分子标记marker37152的实际长度为200bp，其dna序列为如seqidno:3、seqidno:4或seqidno:5中所示的任意一种；分子标记marker37152与梨果心大小主效qtl位点的遗传距离为0cm。
本发明还提供了上述引物对在引物对在检测与梨果心大小主效qtl位点连锁的分子标记marker37152的方法，包括以下步骤：以待检测梨的基因组dna为模板，利用分子标记marker37152的引物对为引物进行pcr扩增，扩增产物经过ta克隆并测序，得到长度557bp大小的dna序列；将上述dna序列与分子标记marker37152的碱基序列进行比对，若上述dna序列内含有如seqidno:3、seqidno:4或seqidno:5所示的3种序列中的任何一种序列信息，则表明存在与qtl位点连锁的分子标记marker37152。
上述梨果心大小主效qtl位点被命名为fcs，位于梨基因组的第12染色体，定位到‘红茄梨’ב晚秀梨’联合遗传连锁图谱的99.33cm处，贡献率为20％。
本发明还提供了上述分子标记marker37152用于检测梨果心大小的方法，包括以下步骤：以待检测的梨基因组dna为模板，利用分子标记marker37152的引物对为引物进行pcr扩增，得到长度557bp大小的dna序列；将上述dna序列与分子标记marker37152的碱基序列进行比对，若上述dna序列内含有seqidno:3所示的序列信息，则该梨果心为大果心表型；若上述dna序列内同时含有seqidno:4和seqidno:5所示的序列信息，则该梨果心为小果心表型。
本发明还提供了上述分子标记marker37152的引物对在梨分子育种中的应用。
本发明还提供了上述分子标记marker37152在梨分子育种中的应用。
本发明中对梨果心大小的定义如下：
根据梨的果心横径与果实横径的比值大小，把果心大小划分为大果心、中等果心、小果心三个表型级别，比值大于等于0.5为大果心，比值大于0.4小于0.5为中等果心，比值小于等于0.4为小果心。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1.目前普遍认可的应用于分子辅助选择的连锁标记与目标性状的距离需≤5.0cm，而本发明所采用的分子标记marker37152与梨果心大小主效qtl位点fcs的遗传距离为0cm，连锁十分紧密，大大提高了分子标记筛选梨果心大小主效qtl的准确性和该性状的育种效率，具有良好的应用价值，可加快对梨果心大小性状的改良。
2.本发明所采用的分子标记marker37152的实际长度为200bp，更加有利于不同种质间基因差异的比较和梨果心大小性状相关功能基因的挖掘。
附图说明
图1为本发明梨果心大小主效qtl位点在‘红茄梨’和‘晚秀梨’的联合遗传图谱第12连锁群上的位置图。其中，lg代表连锁群，lg后的数字代表连锁群数；连锁群上左侧的数字是标记之间的遗传距离，单位为cm，右侧表示的是分子标记的名称；连锁群右侧的实心长方形指示qtl作图区间，连锁群右侧的曲线图为qtl的lod分布图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限定本发明的保护范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例一梨果心大小qtl位点的定位及其连锁分子标记的获得
(1)以梨品种‘红茄梨’为母本、‘晚秀梨’为父本配置杂交组合，获得171株f1代杂交群体。期间部分植株死亡，剩余161株用于构建‘红茄梨’和‘晚秀梨’的联合遗传连锁图谱。
(2)采用slaf标记技术，利用dna限制性内切酶haeiii和rsai对f1群体单株和双亲基因组dna进行酶切，进行3’端加a处理、连接dual-index测序接头、pcr扩增、纯化、混合样品、切胶选取目的片段，文库质检合格后用illuminahiseqtm进行测序，获得slaf标记。其中slaf标记技术的实验操作程序参考xsun.dliu.xzhang等(slaf-seq:anefficientmethodoflarge-scaledenovosnpdiscoveryandgenotypingusinghigh-throughputsequencing[j].plosone.2013:8(3):e58700)的方法。
slaf标记的筛选方法如下：(1)过滤父母本测序深度10×以下的标记；(2)过滤slaf序列中snp数目大于5的标记；(3)过滤亲本完全纯合的多态性标记；第四：过滤基因型覆盖所有子代个体少于70％的标记；(4)过滤卡方检验(p＜0.05)的多态性标记。
按照上述筛选方法，根据f1群体各个标记的亲本序列特征进行‘cp’模型分型，共分为lm×ll、nn×np、hk×hk、ef×eg、ab×cd5种分离类型，缺失标记记为“-”，统计符合slaf标记在f1作图群体中的分离数据，最后获得符合‘cp’模型的高质量slaf标记3984个，结合207个ssr标记，通过joinmap4.0软件对多态性标记位点进行连锁分析，最终构建了一张包含4191个标记的‘红茄梨’和‘晚秀梨’的高密度联合遗传连锁图谱：4191个标记位点分布在17个连锁群，命名为lg1～lg17，覆盖基因组长度1893.61cm，标记间平均距离为0.47cm。
(3)在果实成熟期，调查f1代群体果实横径和果心横径，计算果心横径与果实横径的比值，根据比值的大小把果心大小划分为大果心、中等果心、小果心三个级别，比值大于等于0.5为大果心，比值大于0.4小于0.5为中等果心，比值小于等于0.4为小果心。
本发明中测定了2015年结果的80株‘红茄梨’和‘晚秀梨’的杂交后代f1代单株的果心大小，测量结果如表1所示，2015年结果的80株f1代单株中小果心有21株，中等果心有33株，大果心有24株，2株数据缺失。根据计算的果心横径与果实横径的比值，使用mapqtl5.0软件通过置换检验(permutationtest)(次数>1000)确定阈值，采用区间作图(intervalmapping)检测出lod峰值的标记位点。
表12015年结果的80株f1杂交单株的果心大小数据
(4)结果表明，2015在‘红茄梨’和‘晚秀梨’群体的联合遗传连锁图谱上的第12连锁群检测到果心大小的qtl位点，该位点被命名为fcs，位于梨基因组的第12染色体，如图1所示，fcs定位到‘联合遗传连锁图谱的99.33cm处，与其连锁最近的分子标记为marker37152，fcs与分子标记marker37152的遗传距离为0cm，lod值为3.73，贡献率为20％，该qtl位点fcs为主效qtl。
上述分子标记marker37152位于登录号为ajsu00000000.1的‘砀山酥梨’基因组scaaffold468.0的第180673～180849碱基处；分子标记marker37152的实际长度为200bp，其dna序列为如seqidno:3、seqidno:4或seqidno:5中所示的任意一种；分子标记marker37152与梨果心大小主效qtl位点的遗传距离为0cm。值得说明的是，分子标记marker37152是利用两端测序得到的，包含read1和read2两个序列，共200bp，read1和read2两个序列间有76bp未包含snp的碱基，用n代替。
其中检测与梨果心大小主效qtl位点fcs连锁的分子标记marker37152的方法，包括以下步骤：以待检测梨的基因组dna为模板，利用分子标记marker37152的引物对为引物进行pcr扩增，扩增产物经过ta克隆并测序，可得到长度557bp大小的dna序列；将上述dna序列与分子标记marker37152的碱基序列进行比对，若上述dna序列内含有如seqidno.3、seqidno.4或seqidno.5所示的3种序列中的任何一种序列信息，则表明存在与qtl位点fcs连锁的分子标记marker37152。
上述分子标记marker37152的引物对如下：
正向引物seqidno.1为：5'tgcaccttggttgacgtgcaagttg3'；
反向引物seqidno.2为：5'aggattttatttactaaatgagtgc3'。
pcr扩增体系为(20μl)：10×buffer(mg2+plus)2μl，2.5mmol/ldntp1.6μl，10mmol/l正向引物0.6μl，10mmol/l反向引物0.6μl，taqdna聚合酶0.5u，dna模板50ng，双蒸水补加至总体积为20μl；
pcr扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共32个循环；72℃延伸10min。
实施例二分子标记marker37152及其引物在梨分子育种中的应用
(1)以梨品种‘红茄梨’为母本、‘晚秀梨’为父本配置杂交组合，2015年获得80株结果的f1代杂交群体。
(2)在果实成熟期，调查f1代群体果实横径和果心横径，计算果心横径与果实横径的比值，根据比值的大小把果心大小划分为大果心、中等果心、小果心三个表型级别，比值大于等于0.5为大果心，比值大于0.4小于0.5为中等果心，比值小于等于0.4为小果心。
测定上述80株f1代单株的果心大小，结果如实施例一中的表1所示，2015年结果的80株f1代单株中小果心有21株，中等果心有33株，大果心有24株，2株数据缺失。
(3)利用分子标记marker37152检测上述80株f1代单株的梨果心大小，方法的具体步骤如下：以80株f1代单株的基因组dna为模板，利用分子标记marker37152的引物对为引物进行pcr扩增，得到长度557bp大小的dna序列；将上述dna序列与分子标记marker37152的碱基序列进行比对，若上述dna序列内含有seqidno:3所示的序列信息，则该梨果心为大果心表型；若上述dna序列内同时含有seqidno:4和seqidno:5所示的序列信息，则该梨果心为小果心表型。
上述分子标记marker37152的引物对如下：
正向引物seqidno.1为：5'tgcaccttggttgacgtgcaagttg3'；
反向引物seqidno.2为：5'aggattttatttactaaatgagtgc3'。
pcr扩增体系为(20μl)：10×buffer(mg2+plus)2μl，2.5mmol/ldntp1.6μl，10mmol/l正向引物0.6μl，10mmol/l反向引物0.6μl，taqdna聚合酶0.5u，dna模板50ng，双蒸水补加至总体积为20μl；
pcr扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共32个循环；72℃延伸10min。
(4)结果表明，21株小果心单株中同时含有序列seqidno.4和seqidno.5所示的序列信息的单株为15株，占小果心单株总数的71.4％；24株大果心单株中含有seqidno.3所示的序列信息的单株为16株，占大果心单株总数的66.7％。由此看出，利用分子标记marker37152检测梨果心大小的正确率较高，具有良好的应用价值，可加快对梨果心大小性状的改良。
以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理及工艺条件所做的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。
sequencelisting
<110>中国农业科学院郑州果树研究所
<120>梨果心大小主效qtl位点的分子标记marker37152及其引物对和应用
<130>2017
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