一种具备双单链末端PCR产物的获得方法及其检测方法与流程

本发明属于核酸技术领域，具体涉及一种具备双单链末端pcr产物的获得方法及其检测方法。

背景技术：

聚合酶链式反应(pcr)是一种用于扩增特定的dna片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊dna复制。pcr技术通过将模板核酸在高温(95℃)时变性成单链，在降温后(降至50℃-60℃)引物与模板根据碱基互补配对特异性结合；在最适延伸反应温度(72℃左右)，dna聚合酶以5'-3'的方向合成互补链的反应。整个反应由高温变性、低温退火及适温延伸组成的循环反应进行。一个循环需2～4分钟，2～3小时使目的dna得以迅速扩增，将待扩目的基因扩增放大几百万倍。因pcr技术特异性强、灵敏度高、简便、快速等优点而被广泛应用。不仅常被用于核酸的基础研究，pcr技术也是目前核酸检测的金标准，在医学、生物工程等领域应用广泛。pcr产物是具有平末端的双链dna，一般包括通过琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等进行分离，随后需要借助染色和紫外透射成像进行分析。上述操作步骤繁琐、耗时长，且依赖仪器及特殊训练的专业人员，不适用于高通量、快速的pcr产物检测。

利用核酸试纸条进行检测的技术是一项检测pcr产物的新技术，该技术一般需要对pcr引物序列进行双修饰或者其他特殊的处理：一、双修饰引物：为了在试纸条上进行夹心法检测都需要进行双修饰常用于标记的小分子有biotin，digoxin，fitc，cy3等，。这些小分子都是修饰在引物的末端，当引物与模板退火延伸时，小分子也被掺入到在产物末端，从而达到标记pcr产物的目的。例如wansika等在检测黑斑综合征和白斑综合征病毒核酸时，在两条引物上分别标记biotin和fitc，因此链霉亲和素(sa)包被的胶体金可以通过sa与biotin的高亲和力作用而捕获带biotin-tag的扩增产物。由于在试纸条的t线区域事先划有fitc的抗体，通过fitc抗体与抗原的特异性作用而将带有fitc-tag的产物固定在t线区域，实现了对病毒核酸的快速检测。这种修饰虽然可以实现快速检测，但是需要对引物进行双标记，增加了检测的成本。二、双修饰加高温变性处理：pcr扩增产物一般都是平末端双链，如果不在末端进行分子修饰的话，则没有突出的粘性末端用于杂交；高温变性可以将双链分离而得到单链，通过与被标记在纳米粒子表面的核酸互补配对而固定到纳米粒子表面。例如despina等利用彩色聚苯乙烯纳米微球标记上polyt作为tag，用于捕获带polya的目的核酸序列，用于快速灵敏地检测玉米ivr基因(图1)。ivr的pcr双链片段高温变性成单链后，与带有polya的短链核酸杂交，形成带polya尾巴的双链片段，最后加入polyt聚苯乙烯纳米微球将其捕获；由于事先在pcr的primer上修饰了biotin(生物素)，通过biotin和t线区域的sa高亲和力形成纳米微球-pcr产物-sa复合物，在t线区域形成可视化条带。这样通过双重化学修饰再加上高温变性才能用试纸条进行夹心法检测，成本高且需要高温变性来产生单链，效率低，影响检测灵敏度。

现有的核酸检测试纸条需对引物末端进行修饰才可以完成检测，如专利cn105301237a公开了一种检测核酸的胶体金标检测试剂盒，就需对检测线、质控线及探针使用抗原或半抗原，如生物素、地高辛或荧光染料等进行标记。新型的胶体金核酸试纸条是以胶体金作为示踪标志物，以碱基互补配对原则为基础的检测材料，可以用于核酸的检测。由于在t线、c线区固定是核酸，可以利用碱基互补配对实现对目标序列的检测。设计一段与待测产物(如，单链序列)一侧单链互补的序列用于标金，t线上划有与该产物另一侧单链互补的序列，这样当反应产物到达金标垫时通过碱基互补配对作用将标金序列捕获，形成产物-胶体金的复合物。在层析力的作用下此复合物沿着试纸条向前移动，由于t线序列能跟产物的另一侧单链完全互补而将复合物进行固定，利用胶体金在t线处的聚集而形成肉眼可见的红色条带。c线上划有与标金序列完全互补的序列，当多余的胶体金到达c线时被捕获而显红色，因此作为试纸条可以正常检测的质控标准。由于常规pcr产物仅具有平末端结构，无法满足单链杂交的条件，该方法尚无法进行pcr产物的检测。

紫外线指的是电磁波谱中波长从100nm～400nm辐射的总称，可分为uva(波长320～400nm)、uvb(波长290～320nm)、uvc(波长100～290nm)。已有研究表明，紫外辐射会给生物体带来有害影响，包括基因诱变、致癌作用及细胞死亡等，产生这些有害影响的可能原因是在dna分子内生成了光化学反应产物。在uv的作用下，核酸序列相邻的嘧啶碱基经[2+2]环加成反应形成环丁烷二聚体，其中胸腺嘧啶二聚体是主要的光致产物。。

技术实现要素：

针对平末端pcr产物造成的核酸检测方法繁琐复杂、成本高、灵敏度低的问题，本发明提出一种新的解决方案，无需特殊修饰及其它操作步骤，就可以直接对pcr产物进行检测，达到准确、快速、灵敏、低成本、操作简易的检测需求。

本发明的一个目的是提供一种具备双单链末端pcr产物的获得方法，包括如下步骤：

(1)设计用于扩增目的核酸的正向引物f和反向引物r序列，并在正向引物f和反向引物r序列的5'端分别加上tag1和tag2序列，tag1序列和正向引物f序列之间、tag2序列和反向引物r序列之间分别用若干胸腺嘧啶隔开，合成引物tag1-f和tag2-r；

(2)用紫外线对引物tag1-f和tag2-r的水溶液照射至少30min；

(3)混合pcr反应体系置于pcr仪中进行反应，得到具备双单链末端的pcr产物。

进一步地，步骤(1)中若干胸腺嘧啶的两端分别各加一个腺嘌呤或胞嘧啶，可进一步提高二聚体的形成率。由于tt-cpd(胸腺嘧啶二聚体)吸收光子变成激发态后，很有可能被邻近碱基猝灭，这可能依赖于他们的迁移能或电荷重叠的几何中心，比如碱基和碱基的重叠决定了电子耦合，因此邻近碱基通过影响二聚体的回复并影响其最终生成率。特别是当邻近碱基为鸟嘌呤(g)的时候，回复率最高，导致形成率最低，而使用腺嘌呤或胞嘧啶时，形成率则较高。

进一步地，步骤(1)中胸腺嘧啶的数量为6-10个。

进一步地，步骤(1)中正向引物和反向引物序列长度分别为18-25nt，tag1和tag2序列长度都为12nt。根据不同待检基因可以调整正向引物和反向引物序列，tag1和tag2序列可以通用。tag1和tag2序列可根据引物设计原则进行随机设计，只要不含连续的t即可。

进一步地，tag1和tag2序列为：

tag1：5'-ctgtacgagact-3'

tag2：5'-tctaatgctgat-3'，

上述tag1和tag2序列已证实可以在核酸检测中通用。

进一步地，步骤(2)中紫外线优选波长100～290nm。

本发明的另一个目的是提供上述具备双单链末端pcr产物的检测方法，可选择以下两种方法中的任一种：

(一)直接法：分别设计并合成与tag1和tag2互补的序列c-tag1和c-tag2，并分别在c-tag1和c-tag2的3'端用巯基(-sh)修饰；将修饰过后的c-tag1和c-tag2均通过金硫键(au-s)结合到胶体金粒子上，得到两种不同的胶体金标记产物：aunpdna1和aunpdna2；将aunpdna1和aunpdna2按c-tag1和c-tag2摩尔比0.8-1.2:0.8-1.2混匀制备成红色透明的标记胶体金溶液；将pcr产物加入到标记胶体金溶液中混匀，肉眼观察进行检测及判断，标记胶体金溶液无变化则检测结果为阴性，标记胶体金溶液变浑浊则检测结果为阳性；

(二)试纸条法：分别设计并合成与tag1和tag2互补的序列c-tag1和c-tag2，c-tag1的3'端用巯基(-sh)修饰，合成tag1序列；将修饰后的c-tag1通过金硫键(au-s)结合到胶体金粒子上，得到aunpdna1，并将aunpdna1喷在胶体金试纸条的金标垫上；将c-tag2序列固定在试纸条的检测区(t)；将tag1序列固定在试纸条的质控区(c)；将pcr产物滴加到试纸条的样品垫，滴加上样缓冲液，等待观察结果。

方法(一)利用胶体金的等离子体共振效应，分散的胶体金颗粒呈红色而聚集的胶体金颗粒呈紫色、蓝色，并出现沉淀。因此，通过dna的杂交可将表面具有dna标记的胶体金连接在一起，“拉近”胶体金颗粒之间的距离，并组装成为大分子颗粒从而产生聚沉，此时溶液出现红移现象，颜色改变，并出现肉眼可见的沉淀颗粒，因此可实现对pcr产物的快速检测。本方法的原理如图6所示，形成两侧均有单链末端的pcr产物后，在胶体金的表面通过au-s配位键修饰了两种不同单链dna，它们分别可以与pcr产物末端的tag1和tag2杂交，并发生上述变化。

方法(二)利用pcr产物单链末端tag1与试纸条金标垫上aunpdna1互补，tag2与试纸条检测区上c-tag2互补，通过这两条tag的夹心作用，pcr产物可以被捕获并固定在检测区处产生红线，缺少一条tag都不可能出现红色t线；质控区固定的核酸tag1可以通过与aunpdna1互补而捕获多余的胶体金呈现红色。因此阳性为两条红线，阴性为一条红线(质控区)。

进一步地，方法(二)中采用划膜喷金仪将aunpdna1、c-tag2序列、tag1序列喷或划在胶体金试纸条上。

进一步地，方法(二)中上样缓冲液为：4×ssc，ph7.0，滴加量为10-50μl。

进一步地，方法(二)中pcr产物的上样量为5-10μl。

本发明的另一个目的是提供一种核酸检测试纸条，其依次包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫模块，每相邻的两模块部分重叠，硝酸纤维素膜上依次设置有检测区和质控区；其pcr的正向引物和反向引物序列的5'端分别加上tag1和tag2序列，tag1序列和正向引物序列之间、tag2序列和反向引物序列之间分别用若干胸腺嘧啶隔开；将tag1的互补序列c-tag1与胶体金制备成核酸-金标记物aunpdna1，并将aunpdna1喷在金标垫上；将与tag2互补的序列c-tag2固定在检测区；将tag1序列固定在质控区。

进一步地，样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫都固定在pvc板上。

本发明的另一个目的是提供上述核酸检测试纸条的制备方法，包括如下步骤：(1)将制备好的核酸-金标记物aunpdna1用划膜喷金仪喷在玻璃纤维膜上制成金标垫；(2)将c-tag2序列和tag1序列分别用划膜喷金仪划在硝酸纤维素膜上，分别构成检测区和质控区；(3)将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫模块分别组装在pvc板上，每相邻的两模块重叠1-3mm；(4)将组装好的试纸条切割成2-5mm宽。

本发明的另一个目的是提供一种核酸检测试剂盒，包括试纸条体系和/或标记胶体金溶液；

所述试纸条体系包括核酸检测试纸条和上样缓冲液；

所述核酸检测试纸条依次包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫模块，每相邻的两模块部分重叠，硝酸纤维素膜上依次设置有检测区和质控区；其pcr的正向引物f和反向引物r序列的5'端分别加上tag1和tag2序列，tag1序列和正向引物f序列之间、tag2序列和反向引物r序列之间分别用若干胸腺嘧啶隔开；将tag1的互补序列c-tag1与胶体金制备成核酸-金标记物aunpdna1，并将aunpdna1喷在金标垫上；将与tag2互补的序列c-tag2固定在检测区；将tag1序列固定在质控区；所述样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫都固定在pvc板上；

所述上样缓冲液为：4×ssc，ph7.0；

所述标记胶体金溶液由aunpdna1和aunpdna2按c-tag1和c-tag2摩尔比0.8-1.2:0.8-1.2混和而成；所述aunpdna1和aunpdna2分别为表面修饰c-tag1和c-tag2的胶体金粒子。

本申请人利用紫外照射在引物中形成胸腺嘧啶二聚体，发现可以阻隔pcr聚合酶的延伸作用，使用这种带有胸腺嘧啶二聚体的引物对目的片段进行pcr扩增，可以使pcr产物末端带有单链序列，因此可以使用胶体金核酸试纸条对其进行检测。本发明通过结合含有胸腺嘧啶二聚体引物的pcr技术和核酸试纸条技术，建立了一种简便快捷的检测方法，从而省去电泳等步骤，达到高效、准确、快速、灵敏、低成本、操作简易的检测需求。该方法具有以下优势：

(1)与普通的核酸检测试纸条相比，本发明用pcr这一核酸检测的金标准作为信号放大手段，大大提高了检测灵敏度和通用性。

(2)与现有的阻隔pcr反应不同，本发明不需要对引物进行特殊的修饰，只需要简单的紫外照射处理，就可以达到形成单链末端pcr产物的目的，处理过程简单、无需繁琐的修饰步骤、成本低廉。

(3)与传统的引物修饰的方法相比，本发明省去了修饰的步骤，紫外照射完成后就可以进行pcr反应，不受人员、地区等条件的限制，尤其适用于现场实时检测或缺乏仪器的偏远地区使用。若pcr扩增产物即可直接用标记胶体金溶液或试纸条检测，无需用到抗体或者配体等蛋白，节约了检测成本。

(4)本发明中的tag1和tag2序列可以通用，只要更换与待测目标互补的引物序列，检测所用标记胶体金溶液或试纸条都不用做调整，可直接使用，是一种广谱检测平台，值得推广使用。

(5)使用方便快速，便于实时检测和偏远地区使用，反应在10分钟内即可完成；成本低，不需要特殊的仪器设备；应用范围广，可适应多种检测对象；胶体金本身为红色，不需要加入发色试剂，便于观察。

附图说明

图1现有技术中聚苯乙烯纳米微球检测ivr的pcr产物示意图；

图2实施例1变性胶电泳结果；

图3实施例2含有胸腺嘧啶的引物示意图；

图4胸腺嘧啶二聚体生成机制；

图5实施例2中pcr反应过程；

图6实施例3中利用标记胶体金溶液检测pcr产物的原理图；

图7实施例3中胶体金溶液变化结果；

图8实施例4试纸条结构示意图；

图9实施例4中核酸试纸条检测pcr产物结果及原理；

图10实施例4中pcr产物电泳结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例及附图对本发明做进一步详细说明。

实施例1胸腺嘧啶二聚体阻隔pcr聚合酶延伸

以含有胸腺嘧啶的核酸序列为模板，2t、4t、6t分别表示模板中含有2、4、6个相邻的胸腺嘧啶(如表1所示)，用azp1作为引物，进行引物延伸实验，即只进行单个循环(35℃退火5min，72℃延伸5min)。实验结果如图2所示：用变性page胶进行产物分析，在模板没有经过紫外线照射的情况下，azp1能以2t、4t、6t为模板完全延伸(泳道5、7、9)；当用100～290nm波长紫外线照射模板40min后，以4t和6t为模板的情况下(泳道6、8)，azp1延伸了若干碱基之后就不再延伸，有明显的阻隔产物形成，以6t为模板的情况下最为明显。azp1大约延伸了5-6个碱基，条带位置后移约5个碱基停在24nt的位置。

表1实施例1所涉及序列信息

由于模板中含有胸腺嘧啶二聚体，pcr聚合酶在胸腺嘧啶作用下碱基延伸被阻隔而无法形成完全互补的双链，因此将这种含有胸腺嘧啶二聚体的引物用于pcr反应，可产生两侧都有单链的pcr产物。从上面的实验可以证明紫外照射形成的胸腺嘧啶二聚体阻隔了pcr聚合酶的延伸。

实施例2埃博拉病毒部分序列的pcr扩增

(1)根据genbank中已发布的埃博拉病毒基因组序列选定待pcr扩增的dna片段，序列信息见表2，总长103nt。分别设计正向引物f和反向引物r，并在f、r的5'端分别加上tag1和tag2序列，f和tag1序列之间、r和tag2序列之间分别用6个胸腺嘧啶隔开，分别得到tag1-f和tag2-r。引物及模板关系见图3。

表2ebolatarget单链末端pcr产物扩增实验所需序列信息

(2)用uvc(波长100～290nm)对实验组用的tag1-f和tag2-r的水溶液进行照射30min，使相邻的胸腺嘧啶形成二聚体，分子机制见图4；未照射对照组的引物不经uvc照射。

(3)混合pcr反应体系置于pcr仪中进行反应：设置不加模板ebolatarget的空白对照组，实验组及未照射对照组除用的引物分别为照射和未照射过的外，其余条件均相同。pcr反应体系及pcr循环参数分别见表3、表4；pcr反应过程如图5所示。

表3pcr实验反应体系：

表4pcr实验反应条件：

step2-4循环30次。

实施例3pcr扩增产物的直接法检测

(1)利用柠檬酸钠还原法制备胶体金颗粒：在250ml锥形瓶中加入96ml超纯水，用移液器移取1ml1wt％的haucl4溶液加入其中，同时加入搅拌磁子，搅拌的同时，加热至沸腾。随后，迅速加入3ml1wt％的柠檬酸钠溶液，继续搅拌并保持微沸。溶液颜色随即变黑，继续加热搅拌，可观察到溶液颜色由深变浅，最后由砖红色变为酒红色。等溶液颜色稳定不再变化后，继续加热搅拌10min。继续搅拌，待溶液降至室温，制备得到粒径15±2nm的胶体金颗粒。

(2)在胶体金颗粒表面通过au-s配位键标记两种不同单链dna(即为标金序列：分别为c-tag1、c-tag2(表2)，其3'端进行巯基修饰)。在2ml胶体金溶液中加入50μl标金序列(10μmol/l，c-tag1/c-tag2)，225μl水，350μl100mmol/lpbs(ph8.0)，350μl0.1wt％sds，525μl2mol/lnacl(视胶体金溶液稳定性差异进行分步滴加，逐次提高标金溶液中的nacl浓度)，室温放置过夜。12000r/min离心10min，弃上清并用1ml0.01wt％sds洗涤沉淀，重复操作两次，沉淀重溶于1ml保存液(0.3mol/lnacl、10mmol/lpbs、0.01％sds)中。至此，制备得到两种表面修饰有单链dna的胶体金溶液。

(3)利用表面修饰dna的胶体金对pcr产物进行检测，原理如图6所示。取20μl实施例2的pcr扩增产物，加入40μlc-tag1修饰的胶体金溶液和40μlc-tag2修饰的胶体金溶液，加入1/4体积分数的乙醇后混匀静置，经10-20min即可观察到可视溶液变化出现。如图7所示的结果，未加入pcr产物、空白对照组及未照射对照组的胶体金溶液颜色均没有改变，而加入pcr产物后的胶体金溶液颜色发生变化，说明pcr产物可以在胶体金溶液中充当linker的作用，能够拉近胶体金之间的距离，并组装形成大分子颗粒，最终使胶体金颗粒发生聚沉，通过肉眼可以观察到溶液的颜色变化及沉淀出现。该方法证明了经过uv照射的引物能够使pcr产物末端形成两条单链，且用该方法可直接针对pcr产物进行检测。

实施例4pcr扩增产物的试纸条法检测

(1)分别设计并合成与tag1和tag2互补的序列c-tag1和c-tag2，c-tag1的5'端用巯基(-sh)修饰，合成tag1序列。

(2)将修饰后的c-tag1通过金硫键(au-s)结合到胶体金粒子上，得到核酸-金标记物aunpdna1，并将aunpdna1喷在胶体金试纸条的金标垫(玻璃纤维膜)上；将c-tag2序列用划膜喷金仪固定在硝酸纤维素膜的检测区(t)；将tag1序列用划膜喷金仪固定在硝酸纤维素膜的质控区(c)。

如图8所示，将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫模块分别组装在pvc板上，每相邻的两模块重叠2mm，保证层析过程顺利进行；将组装好的试纸条用自动斩切机，切割成3mm宽。

(3)将5μl实施例2的pcr产物滴加到试纸条的样品垫(实验组和对照组分别滴加到不同试纸条)，逐滴滴加15μl4×ssc，让样品在试纸条上缓慢前行，5分钟后观察结果，实验组在检测区(t)和质控区(c)各出现一条红色条带，说明pcr反应正常进行并得到了目标产物，检测结果及原理见图9。未照射对照组和空白对照组在检测区(t)和质控区(c)均未出现条带。

另外，为验证试纸条的可靠性，对上述pcr产物同时进行了传统的电泳检测，如图10所示，图中可见，未照射对照组在150bp左右有特异性扩增条带，实验组在200bp左右有目标产物，空白对照组无特异性条带。充分证实上述直接法和试纸条法检测pcr产物的准确度高。

相比于传统的电泳检测pcr产物的方法，本发明的方法无需进行引物修饰，pcr产物可直接进行检测，并节省了电泳、染色的过程，检测更简单、省时，准确度高、灵敏度高，pcr产物检测用量可微至5μl，仅需5-10min即可得到检测结果。

sequencelisting

<110>中国海洋大学

<120>一种具备双单链末端pcr产物的获得方法及其检测方法

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