生物条形码检测中的NP探针、其制备方法与生物条形码检测试剂盒与流程

本发明涉及生物技术领域中的生物条形码检测技术，特别是涉及其中的一种与NP探针联结的单链条形码DNA、新型NP探针、该探针的制备以及基于该新型NP探针形成的生物条形码检测试剂盒，本发明可用于与该单链条形码DNA无核酸序列同源性的病毒抗原的高灵敏度检测。

背景技术：
生物条形码检测技术(bio-barcodesassay，BCA)于2003年Mirkin等开发以来，为分子诊断领域，尤其是微量蛋白质检测提供了一个全新的技术平台(NamJM,ThaxtonCS，MirkinCA.Nanoparticle-basedbio-barcodesfortheultrasensitivedetectionofproteins.Science，2003，301(5641):1884-1886)。该技术检测蛋白的原理是利用标记被检物单抗的磁性微球(magneticmicroparticles，MMP)、标记被检物多抗和条形码DNA链的金纳米颗粒(nano-particle，NP)，通过形成MMP-被检物-NP三明治复合物，利用磁场进行分离，洗脱释放NP上标记的条形码DNA链，通过PCR或银染法鉴定就可确定被检物的存在。BCA技术中，NP探针标记有双链DNA(48bp)和病原的多克隆抗体，双链DNA的其中一条和胶体金颗粒通过Au-S键相连，另一条和前者互补是用来指示被检物的条形码DNA，每一个直径为30nm的胶体金上大约标记有400条左右的条形码DNA链(HurstSJ,Lytton-JeanAR,MirkinCA.MaximizingDNAloadingonarangeofgoldnanoparticlesizes.AnalChem,2006,78:8313-8318)；MMP探针是对应于分选磁场的直径约为1μm的磁珠微球，其表面上包被有抗病原的单克隆抗体。BCA技术通过抗原抗体高度特异性反应捕获抗原，再通过检测条形码DNA而实现对被检物的间接检测，由于双链DNA标记的一次放大以及PCR反应和芯片检测的二次放大效应，使检测灵敏度得到极大提高。发明人所在实验室对传统BCA技术进行了改进，先后建立了用于蓝舌病病毒检测的新型BCA检测技术(YinHQ,JiaMX,YangS,JingPP,WangR,ZhangJG.Developmentofahighlysensitivegoldnanoparticleprobe-basedassayforbluetonguevirusdetection.JournalofVirologicalMethods,2012,183(1):45-48)以及蓖麻毒素检测的新型BCA检测技术(YinHQ,JiaMX,ShiLJ,LiuJ,WangR,LvMM,MaYY,ZhaoX,ZhangJG.Evaluationofanovelultra-sensitivenanoparticleprobe-Basedassayforricindetection.JournalofImmunotoxicology,2013,earlyonline:1-5)，其中蓖麻毒素新型BCA检测方法申报并获得了国家发明专利(ZL201010530075.2,2013-06-19，申请日2010-10-29)。在上述新型BCA检测技术中，标记的条形码DNA链改进为单链，其长度为90个碱基(如序列表中SEQIDNo：5所示)，其长度适于进行TaqMan探针法的荧光定量PCR检测，但是这一长度的DNA链容易在NP探针表面形成弯曲折叠结构，从而不利于后续基于抗原-抗体反应的NP-被检物-MMP免疫复合物的形成。此外，NP探针制备中，仅采用离心法去除未标记到NP上的游离条形码DNA，这一制备方法不易去除游离条形码DNA，而游离条形码DNA的残留会导致BCA检测的假阳性结果。

技术实现要素：
针对现有BCA检测技术中存在的不足，本发明目的在于改进BCA检测技术，提供一种新型NP探针以及该探针的制备方法。本发明首先提供一种生物条形码检测中与NP探针联结的单链条形码DNA，所述条形码DNA长度少于90碱基仍适用于荧光定量PCR/TaqMan荧光探针检测的长度，优选为60个碱基。具体的，该单链条形码DNA核苷酸序列如序列表中SEQIDNo：1所示。本发明进一步提供一种生物条形码检测中的NP探针，其金纳米颗粒上包被有如上所述的长度少于90碱基的单链条形码DNA。所述生物条形码检测中的NP探针中，金纳米颗粒上还包被有被检病原的多抗，所述被检病原的核酸序列与所述单链条形码DNA无同源性。例如丙型肝炎病毒核酸序列与单链条形码DNA无同源性，因而可对丙型肝炎病毒进行检测，可采用抗丙型肝炎病毒的多抗进行包被，同理，也可采用乙型肝炎病毒多抗标记以用于乙型肝炎病毒抗原的检测。本发明提供一种生物条形码检测中NP探针的制备方法，包括以下步骤：1)合成所述的单链条形码DNA；2)在金纳米颗粒上分别标记被检病原的多抗和所述单链条形码DNA；3)用脱氧核糖核酸酶(DNaseⅠ)降解未标记上的游离单链条形码DNA；由此得到NP探针。以上所述生物条形码检测中NP探针的制备方法，所述步骤3)的过程为：将1体积的DNaseⅠ(100U)、1体积的25mMMgCl2、1体积的小牛血清和5体积的0.01MPBS混合均匀，加入2体积的步骤2)得到的标记有多抗和DNA的纳米金颗粒PBS重悬液中，37℃孵育2h，4℃、13000g离心10min，去除上清，0.01MPBS重悬沉淀得到去除了游离单链条形码DNA的NP探针，4℃保存。本发明进一步目的在于提供一种基于该新型NP探针形成的用于新型生物条形码检测的产品。此类产品可以为生物条形码检测中的MMP-核心抗原-NP三明治复合物，是将所述NP探针、MMP探针和被检病原抗原通过抗原、抗体作用制备得到，所述MMP探针为标记有抗被检病原单抗的磁珠。此类产品还可以为生物条形码检测试剂盒，其中包括所述NP探针、标记有抗被检病原单抗的MMP探针以及用于实时荧光定量PCR检测的引物对和TaqMan荧光探针。具体的，该生物条形码检测试剂盒中，用于实时荧光定量PCR检测的引物对的上游引物的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo：2所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo：3所示，TaqMan荧光探针的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo：4所示。以上单链条形码DNA、NP探针、MMP-核心抗原-NP三明治复合物或试剂盒可用于核酸序列与所述单链条形码DNA无同源性的病原的抗原检测。具体的，所述试剂盒为丙型肝炎病毒核心抗原生物条形码检测试剂盒，其中包含：包被有抗丙型肝炎病毒核心抗原多抗和条形码DNA的NP探针、包被有抗丙型肝炎病毒核心抗原单抗的MMP探针以及用于实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan荧光探针。以丙型肝炎病毒核心抗原的检测为例，基于本发明的新型生物条形码检测是在普通生物条形码检测方法的基础上，将单链条形码DNA的长度改为60碱基，其长度可适用于荧光定量PCR/TaqMan荧光探针检测，三明治反应复合物中条形码DNA链不用解离，直接用基于TaqMan荧光探针的实时荧光定量PCR方法对三明治反应复...