生物探针及其应用
【专利说明】生物探针及其应用
[0001] 本发明涉及可用于检测含有多核苷酸的靶标分子中互补性单核苷酸或核苷酸序 列的存在的生物探针。
[0002] 在分析分子生物学中广泛应用典型地包含长度少于1000个核苷酸的已知序列顺 序的单链寡核苷酸的生物探针。当在探针与靶标的核苷酸碱基之间存在完全的或基本上完 全的序列互补性时，所述探针典型地通过将其连接到靶标（例如，来源于天然存在的病原 体的DNA的靶标）来起作用。典型地，所述探针的核苷酸标记有可检测元件，如放射性或 荧光标记物，以使当所述探针用于处理分析物溶液或底物（据信其中或其上已经捕获了靶 标）时，通过寻找并检测所述检测元件的特征性检测特性来揭示所述靶标的存在与否。
[0003] -类这样的探针由本领域中被称为'分子指示标（molecular beacons) '的物质 所代表；例如，如在W002/06531或US 8211644中所述。这些探针由单链寡核苷酸组成，所 述单链寡核苷酸实际上回折于其自身上从而产生充当探针的传感器的残余的单链环和短 的茎，在所述茎中，邻近两个末端的核苷酸通过互补核苷酸碱基配对彼此结合；由此产生双 链的区域。这种布置是高度紧张的，所述布置可以连接到发夹，在所述发夹中，单链环连接 到名义上的双链寡核苷酸（即，所述茎）的同一末端的互补链。所述寡核苷酸的游离的3' 和5'端（现在彼此邻近并且在茎的远端）分别连接荧光团和猝灭剂。其彼此接近确保了 不产生显著的荧光。使用时，靶标与单链环结合，产生额外的应变，所述应变然后使得所述 茎解链，由此使所述荧光团和猝灭剂远离，并且允许前者发出荧光。这些探针的一个缺点是 所述环需要相对长，例如，20-30个核苷酸，这使得其不适合检测较小的靶标，并且尤其是不 适合检测包含单个核苷酸的那些靶标。
[0004] US 2006/063193描述了一种检测方法，所述方法包括使未知的单链分析物与各自 具有不同序列的不同探针类型的阵列接触；使所述分析物与其互补探针杂交，并且通过对 杂交的探针进行质谱法确定序列。然而，与本发明的方法不同的这种方法尤其不适于鉴定 单个核苷酸或小的寡核苷酸片段。
[0005] EP 1662006教导了 DNA探针，所述DNA探针来源于两种不同长度的互补寡核苷酸 链，其中较长的那个被设计为单链靶标的序列互补物。在其未使用的状态，所述探针由此包 含双链区和单链区，所述单链区可以识别靶标并且通过杂交与靶标部分连接。然后，探针中 的两条链中较短的那个和靶标序列的其余部分可以交换，这能够允许所述分析物与所述探 针完全杂交。在一个实施方案中，探针的两条链上相应的核苷酸用成对的荧光团和猝灭剂 功能化，使得未使用的探针不发出荧光。然而，当较短的链被靶标的其余部分交换掉时，所 述荧光团被释放出来发出荧光。
[0006] W0 2006/071776描述了一种基于连接的RNA扩增方法，其包括使用包含双链区和 单链3'端区域的核酸。在这种方法中，RNA的5'端连接到单链区，并且3'端连接到双链 区的5'链。然后，可以利用已知的技术扩增RNA。然而，所述核酸没有表现为标记有可检测 元件。
[0007] W0 2009/120372教导了一种方法，其中未知序列的双链寡核苷酸先通过首先将第 一和第二发夹单链区与其末端连接而转化成模板核酸。然后，这样产生的模板可以用于利 用涉及引发发夹的常规聚合酶介导的测序方法在正义和反义方向上同时对双链寡核苷酸 进行测序；分离双链寡核苷酸的组成链：并且沿着所分离的链延伸引物。然而，模板中的核 苷酸似乎无一被可检测元件标记。
[0008] 现在我们开发了替代的生物探针，其中可检测元件基本上是不可检测的，除非将 其通过一系列生化/酶反应特异性激活，所述反应从所述探针释放一个或一级联的处于更 容易检测状态的可检测元件。这样的生物探针可用于靶标浓度非常低的情形，并且尤其可 用于这样的情形，其中靶标包含一串单核苷酸，其关联的核苷酸碱基顺序对应于需要确定 序列的未知生物分子的顺序。这使得可能在高通量DNA测序装置中使用本发明的探针。
[0009] 因此，根据本发明，在本发明的第一方面提供一种生物探针，其特征在于，其包含 单链核苷酸区，所述单链核苷酸区的末端分别连接两个不同的双链寡核苷酸区，其中所述 寡核苷酸区中的至少一个包含具有特征性检测特性的可检测元件，并且其中所述可检测元 件被这样布置在所述寡核苷酸区上以致所述可检测特性的可检测性比在相同数量的可检 测元件结合到相应数量的单个核苷酸时低。
[0010] 在一个优选的实施方案中，所述可检测元件包含荧光团，并且所述探针本身在用 于检测所述荧光团的那些波长基本上不发荧光。因此，尽管荧光团可能在电磁谱的大部分 表现出普遍的、低水平的背景荧光，但是典型地将存在一个或少量的特定波长或波长范围 (wavelength envelopes)其中焚光的强度处于最大值。在特征性检测所述焚光团的这些 最大值中的一个或多个，基本上不应当产生荧光。在本发明的情形中，术语'基本上不发荧 光'或等价的词语意指与探针相连的全部荧光团在相关特征波长或波长范围的荧光强度不 到等量的游离荧光团的相应的荧光强度的25% ;优选不到10% ;更优选不到1%，并且最优 选不到0. 1%。
[0011] 原则上，可以使用任何方法确保在探针的未使用状态，所述荧光团发出的荧光不 如当其各自结合到其本身的单个核苷酸上时。一种方法是另外地将猝灭剂与其紧邻地相 连。另一种方法是基于这样的观察：当多个荧光团彼此紧邻地连接到同一个探针上时，它们 倾向于彼此充分猝灭，使得可以在不需要猝灭剂的条件下实现前段所述的标准。在本专利 的这种情形中，构成荧光团之间或荧光团与猝灭剂之间的'紧邻'的因素取决于所用的特定 的荧光团和猝灭剂，并且可能取决于寡核苷酸区的结构特征。由此，意欲根据所需的结果解 释该术语，而不将其解释为在探针上的任何特定的结构布置。然而，并且为了提供示例的目 的，要指出的是，当邻近的荧光团或邻近的荧光团与猝灭剂相隔以一段距离，并且所述距离 对应于其特征性F6rster距离（典型地小于5nm)时，将获得充分的猝灭。
[0012] 优选地，包含探针的寡核苷酸区中的至少一个用多至20个、优选多至10个、并且 最优选多至5个荧光团标记。为了获得的最大的优点，优选的是，至少一个寡核苷酸区用至 少2个、优选至少3个荧光团标记。因此，本文特别预期由这些最大值与最小值的任意置换 构建的范围。如果使用猝灭剂，类似地，优选的是，所述探针用多至20个、优选多至10个、并 且最优选多至5个猝灭剂标记。尽管预期可以将超过一种类型的荧光团与探针连接，以便 例如给予其特征性指纹，但是，优选的是，与给定探针连接的所有探针都是相同类型的。优 选地，所述荧光团和猝灭剂在所述寡核苷酸区的不同链上或者彼此相对（在其通过折叠单 链寡核苷酸前体产生的情况下）。
[0013] 关于荧光团本身，它们原则上可以选自任意本领域中常规使用的那些，包括但不 限于咕吨部分，例如，荧光素，罗丹明及其衍生物，如荧光素异硫氰酸酯，罗丹明B等；香豆 素部分（例如，羟基_、甲基-和氨基香豆素）和青色素部分如Cy2，Cy3，Cy5和Cy7。具体 的实例包括来源于下述常用染料的荧光团：Alexa染料，花青染料，Atto Tec染料，和罗丹 明染料。实例还包括：Atto 633 (AITO-TEC GmbH)，Texas Red，Atto 740 (AITO-TEC GmbH)， Rose Bengal，Alexa Fluor? 750C5-马来醜亚胺（Invitrogen)，Alexa Fluor? 532C2-马 来酰亚胺（Invitrogen)和Rhodamine Red C2-马来酰亚胺和Rhodamine Green以及亚磷 酰胺（phosphoramadite)染料如Quasar 570。备选地，可以使用量子点或近红外线染料如 由LI-COR Biosciences所供应的那些。典型地使用本领域中已知的化学方法经由核苷酸 碱基将荧光团与寡核苷酸连接。
[0014] 合适的猝灭剂是通过Fdrster共振能量转移（FRET)机制起作用的那些。可以结合 上述焚光团使用的可商购的猝灭剂的非限制性实例包括但不限于DDQ_l，Dabcyl，Eclipse， Iowa Blac