[0028] 其中X是用Quasar 570 (荧光团）标记的T碱基，并且其中Y是用BHQ-2猝灭剂标 记的T碱基，所述前体通过将其水溶液加热至95°C然后以10分钟/°C的速率缓慢冷却回到 室温而围绕第49个核苷酸碱基折叠。在此时间的末尾，形成根据本发明的闭环末端探针， 其中第49个核苷酸碱基（此处为T)构成单链核苷酸区，并且长度分别为24和27个核苷 酸碱基对的两个双链寡核苷酸在其侧面。
[0029]实施例2-4
[0030] 将实施例1的方法再重复三次，不同之处在于，对所述103个核苷酸的前体进行改 变，以使第49位的核苷酸碱基是G (实施例2)，C (实施例3)和A (实施例4)，以产生另外三 种对不同的核苷酸碱基有选择性的探针。在这些实施例中的每一个中使用的X碱基是分别 用以下各项标记的 T 喊基：Fluorescein (517nm)，Texas Red (612nm)和青色素-5 (667nm)〇
[0031]实施例5
[0032] 通过将等摩尔量的实施例1-4的四种探针在室温混合在水溶液中而产生探针混 合物。
[0033]实施例6
[0034]将实施例5的混合物用547纳米激光激发（interrogated)，并且使用光检测器在 570nm测量荧光程度。然后，加入包含具有关联的A碱基的单核苷酸的水溶液（单核苷酸与 探针的摩尔比是1:50)以及催化量的Klenow片段聚合酶（由DNA聚合酶I (ex. E. Coli)和 枯草杆菌蛋白酶产生）和大肠杆菌（E.coli)DNA连接酶。一小时后，再次测量荧光，之后加 入催化量的限制酶Sbfl与X外切核酸酶的水溶液。再经过一小时后，再次测量荧光程度。 发现在前两种情况下在570nm测量的荧光比在最后一种情况下测量的荧光小99%。
[0035]图1使用凝胶层析数据来举例说明核苷酸-捕获步骤的作用。泳道A显示从上述 类型的占用的探针的样品得到的结果。泳道B显示在加入相关的核酸（dNTP形式）、聚合酶 和连接酶后来自相似样品的结果。可以看到存在第二条带，其指示完整的探针的存在。
[0036]图2使用凝胶层析数据来举例说明限制性内切核酸酶在切割完整的探针时的作 用。泳道A显示完整的探针，泳道B显示所述探针与所述限制酶接触一段时间后的状况。泳 道B中多条条带的存在表明已经发生切割成两个片段的事实。
[0037] 最后，图3用图显示在上述类型的切割的'黑暗的（dark) '完整的探针经受进行的 核酸外切降解从而以活性状态释放其组成荧光团后荧光随时间的发展。
【主权项】
1. 生物探针，其特征在于，其包含单链核苷酸区，所述单链核苷酸区的末端连接两个不 同的双链寡核苷酸区，其中所述寡核苷酸区中的至少一个包含具有特征性检测特性的可检 测元件，并且其中所述可检测元件被这样布置在所述寡核苷酸区上以致所述检测特性的可 检测性比在相同数量的可检测元件结合到相应数量的单个核苷酸时低。2. 权利要求1所述的生物探针，其特征在于，所述可检测元件包含荧光团，并且所述探 针在所述荧光团的检测波长或波长范围基本上不发荧光。3. 权利要求2所述的生物探针，其特征在于，所述寡核苷酸区包含通过所述单链核苷 酸区连接在一起的第一和第二双链寡核苷酸，并且其中所述双链寡核苷酸中的至少一个用 彼此紧邻的多个荧光团标记。4. 权利要求2或权利要求3所述的生物探针，其特征在于，所述双链寡核苷酸中的至少 一个用与所述荧光团紧邻的猝灭剂标记。5. 权利要求4所述的生物探针，其特征在于，所述单链核苷酸区由多至50个核苷酸组 成。6. 权利要求5所述的生物探针，其特征在于，所述单链核苷酸区由单个核苷酸组成。7. 权利要求6所述的生物探针，其特征在于，所述单个核苷酸由选自胸腺嘧啶、鸟嘌 呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶中的一个的核苷酸碱基组成。8. 前述权利要求中任一项所述的生物探针，其特征在于，每个双链寡核苷酸区由多至 50个核苷酸对组成。9. 权利要求8所述的生物探针，其特征在于，每个双链寡核苷酸区由10-30个核苷酸对 组成。10. 权利要求8或权利要求9所述的生物探针，其特征在于，双链寡核苷酸区中多至10 个核苷酸对用焚光团标记。11. 权利要求2-10中任一项所述的生物探针，其特征在于，双链寡核苷酸区中多至10 个核苷酸对用猝灭剂标记。12. 前述权利要求中任一项所述的生物探针，其特征在于，使用两个不连续的双链寡核 苷酸，其各自包含远离所述单链核苷酸区的末端，所述末端是闭环。13. 权利要求12所述的生物探针，其特征在于，所述双链寡核苷酸区通过以下方式来 源于单链寡核苷酸前体：将所述单链寡核苷酸前体的末端回折于其自身上，留下包含所述 单链核苷酸区的缺口。14. 前述权利要求中任一项所述的生物探针，其特征在于，其包含至少一个限制酶识别 位点。15. 权利要求13所述的生物探针，其特征在于，所述限制酶识别位点通过将靶标连接 到所述单链核苷酸区产生。16. 前述权利要求中任一项所述的生物探针，其特征在于，其被支持在基底上。17. 使用前述权利要求中任一项所述的生物探针检测靶标的方法，其特征在于，其包含 下述步骤：将所述靶标连接到所述探针的所述单链核苷酸区，以产生完全是双链的占用的 探针。18. 权利要求17所述的方法，其特征在于，其包含下述另外的步骤：用限制酶和外切核 酸酶处理所述占用的探针，从而释放能够被检测的形式的可检测元件。19. 权利要求18所述的方法，其特征在于，其包括观察由所述释放的可检测元件表现 出来的可检测特性。20. 权利要求17-19中任一项所述的方法，其特征在于，所述可检测元件是荧光团。21. 权利要求17-20中任一项所述的方法，其特征在于，所述占用的探针包含限制酶识 别位点，所述限制酶识别位点通过将所述靶标连接到所述单链核苷酸区形成。22. 权利要求17-21中任一项所述的方法，其特征在于，所述靶标是单个核苷酸，并且 其与四种不同的生物探针的混合物接触，所述四种不同的生物探针各自具有单链核苷酸 区，所述单链核苷酸区包含选自以下的不同的单个核苷酸：（1)鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和 胸腺嘧啶或（2)鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶。23. 权利要求22所述的方法，其特征在于，所述四种探针中的每一种具有不同的可检 测元件。24. 权利要求23所述的方法，其特征在于，所述不同的可检测元件是荧光团。25. 权利要求22-24中任一项所述的方法，其特征在于，所述靶标包含对应于DNA或 RNA样品中的核苷酸的序列的一串单核苷酸。26. 制备权利要求1所述的生物探针的方法，其特征在于，其包括下述步骤：（1)由核苷 酸亚磷酰胺单体合成单链寡核苷酸前体，（2)折叠所述前体的末端，以产生在单链核苷酸区 的每一侧并置的两个双链寡核苷酸区。27. 用于对来源于DNA或RNA样品的多核苷酸中的核苷酸碱基进行测序的装置，其特征 在于，所述装置使用权利要求25的方法和用于检测荧光的检测器。
【专利摘要】本发明公开了生物探针，其特征在于包含末端连接两个不同寡核苷酸区的单链核苷酸区其中寡核苷酸区中至少一个包含具有特征性检测特性的可检测元件且其中可检测元件被布置在寡核苷酸区上以致可检测特性的可检测性低于当相同数量的可检测元件结合到相应数量的单个核苷酸时。该生物探针尤其可用于捕获单个核苷酸或单链核苷酸以产生可由限制酶和外切核酸酶降解的占用探针从而产生携带可检测形式的可检测元件的单个核苷酸。典型地可检测元件是荧光团且通过如使用多个相邻的荧光团或荧光团和与其连接的猝灭剂的混合物使探针中相应的特征性荧光不可检测。优选地单链核苷酸区由单个核苷酸组成，其关联的核苷酸碱基是DNA或RNA中发现的特征性核苷酸碱基之一。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN104884635
【申请号】CN201380062825
【发明人】卡梅伦·亚历山大·弗雷林, 巴纳比·巴姆福思, 布鲁诺·弗拉维奥·诺盖拉·德·索萨·苏亚雷斯, 托马斯·亨利·艾萨克, 鲍里斯·布赖纳, 亚历山德拉·纳塔莱, 米歇尔·阿马西奥
【申请人】贝斯4创新公司
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2013年10月4日
【公告号】CA2887320A1, EP2904114A1, US20150275293, WO2014053853A1