在原生动物中重组制备鲎c因子蛋白的方法
【技术领域】
[0001] 本发明提供一种重组制备来自鲎的C因子蛋白的新方法，所述方法使用表达所述 C因子蛋白的寄生原生动物。相应地，本发明提供含有编码鲎C因子蛋白的多聚核苷酸的寄 生原生动物宿主细胞以及制备C因子的方法，该方法包括在使得所述细胞表达所述鲎C因 子蛋白的条件下培养所述寄生原生动物宿主细胞。本发明提供由所述新方法制备的重组鲎 C因子蛋白和它在内毒素的检测和/或清除中的用途。
【背景技术】
[0002] 内毒素（也已知为脂多糖（LPS))是革兰氏阴性细菌细胞膜的一种基本成分，并造 成许多（如果不是全部）发生在革兰氏阴性细菌败血症期间的毒性作用。
[0003] 来自革兰氏阴性细菌的LPS引起鲎的变形细胞聚集和成颗粒状。据推测，LPS引起 的凝聚级联代表鲎用来对抗革兰氏阴性细菌入侵的一种重要的防卫机制。几十年来，变形 细胞溶解物作为鲎变形细胞溶解物（LAL)试验的组成已被用作检测溶液中痕量浓度的内 毒素（LPS)的工具。鲎中凝聚的分子机制已经被建立了，并且它与蛋白酶的级联有关。这 个级联是基于3种丝氨酸蛋白酶酶原、C因子、B因子、凝固酶原以及一种可凝结蛋白、凝固 蛋白原。作为凝固级联的最初激活剂，C因子作为对LPS作出反应的生物传感器。一旦C因 子被LPS "激活"，产生的活性部分具有激活B因子和水解合成的三肽底物的能力。
[0004] C因子活性是用于飞克水平内毒素的非常敏感的分析的基础，其应用于制药产品 以及诸如此类的产品的质量控制中。因此，C因子在内毒素检测中的重要性导致了作为可 替代来源的重组C因子（rFC)的表达，这种可替代来源应该减轻用传统的变形细胞溶解物 的公认的缺点，像内毒素检测灵敏度的季节性变动。
[0005] 为了内毒素的特异性分析，C因子蛋白已被纯化和克隆。当被LPS激活时，重组C 因子对存在于分析混合物中的合成底物起作用以产生可检测的信号，由此指示在指定样品 中LPS的存在。具体地，荧光底物产生与所述样品中的内毒素浓度成比例的荧光信号。C因 子蛋白已经被纯化和克隆以用于其在内毒素-特异性分析中的应用。
[0006] Nakamura 等（1986, Eur. J. Biochem. 154:511-521)描述了 来源于中国豐 (Tachypleus tridentatus)的天然C因子蛋白的分离和特征。Muta等（1991，J.Biol. Chem.266:6554_6561)公布了编码来源于中国豐（T.tridentatus)的C因子蛋白的cDNA序 列。Ding等（1995，Molecular Marine Biology and Biotechnology 4:90-103)公布了编码 来源于圆尾豐（Carcinoscorpius rotundicauda)的 C 因子蛋白的 cDNA 序列。Roopashree 等（1995, Biochem. Mol. Biol. Inti. 35:841-849)描述了来源于圆尾豐（C.rotundicauda) 的C因子在大肠杆菌中的重组表达。在此，108kDa的酶原的表达以及78kDa和52kDa的激 活形式由免疫检测显示出来。
[0007] Ding 等（1996, US 专利 5, 858, 706)描述了 来源于圆尾豐（C. rotundicauda) 的C因子蛋白在巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris)中的重组表达。Roopashree等 (1997, Biotechnology Letters 19:1147-1150)描述了来源于圆尾豐（C.rotundicauda) 的C因子蛋白在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)中的重组表达。
[0008] Roopashree 等（1997, Biotechnology Letters 19:357-361)描述了来源于圆尾 鲎（C.rotundicauda)的C因子蛋白在哺乳动物C0S-1细胞中的重组表达。在此，C因子蛋 白被表达，具有132kDa、130kDa和63kDa分子量的蛋白条带被检测到。这些蛋白是非分泌、 不可溶和无活性的，而是不溶的，与细胞碎片组分结合。
[0009] Wang 等（2001，Biotechnology Letters 23:71-76)描述了 来源于圆尾豐 (C.rotundicauda)的C因子蛋白在昆虫细胞（稳定转染的Sf9细胞）中的重组表达。在 此，C因子蛋白被分泌到上清液中，具有132kDa分子量，其表明蛋白的糖基化。在它可以结 合内毒素（LPS)的意义上，所获得的C因子是有功能活性的。然而，没有显示出向有酶促活 性的蛋白酶的转变。Wang等（2002, J. Biol. Chem. 277:36363-736372)也描述了来源于圆尾 豐（C. rotundicauda)的C因子蛋白在昆虫细胞中的重组表达。在此，C因子被克隆并转染 到果蝇S2细胞，并以糖基化的可溶性蛋白被表达，该糖基化的可溶性蛋白被分泌到培养物 上清液中。重组C因子蛋白能结合LPS，但是不能分裂成有酶促活性的蛋白酶。来源于圆尾 鲎（C.rotundicauda)的C因子蛋白在昆虫细胞中的重组表达在US 6, 645, 724中有进一步 的描述，使用在Sf9细胞中表达的杆状病毒系统。
[0010] C因子蛋白是一种复杂的真核蛋白，需要几个转变步骤和二级修饰以变为有活性 的蛋白酶。在原核生物（如，大肠杆菌）中的重组表达不提供糖基化、分裂成H链和L链以 及正确的二硫键的形成。在简单的真核表达系统（如，酵母）中的细胞质表达提供C因子， 该C因子能结合LPS，但在结合LPS时不被激活，即，没有从酶原形式转变到有活性的蛋白 酶。当使用酵母细胞（毕赤酵母属或酵母菌属）用来表达时，不可能获得作为分泌蛋白的 重组C因子。在哺乳动物细胞系中的表达也不提供有活性的分泌蛋白。此外，在稳定转化 的昆虫细胞中的表达提供分泌蛋白，该分泌蛋白能够结合LPS。然而，被LPS激活在这个系 统中没有显示。最后，在使用杆状病毒表达系统的昆虫细胞中的表达提供了分泌C因子蛋 白，该分泌C因子蛋白能够结合LPS，并在结合LPS时转变成有活性的丝氨酸蛋白酶酶原。
[0011] 从到目前为止所获得的所有经验，在昆虫细胞中成功表达有活性的C因子蛋白的 专家推断出"在昆虫细胞中的表达，而不是在原核或简单的真核表达系统中的表达，适于制 备具有完全生物活性的rFC。此外，鲎和昆虫属于相同的门（节肢动物门），因而在它们的 生理和生化上，昆虫细胞比酵母细胞更近似于鲎的细胞。因此，在昆虫细胞中制备的rFC可 能更近似于从鲎中纯化的蛋白，并且保留了具有被LPS激活的丝氨酸蛋白酶活性的生物活 性"（见TO 99/15676第2页，"发明摘要"）。
[0012] 从那时起，即，W0 99/15676公开后的13年多，关于有活性的C因子蛋白的重组制 备没有做进一步尝试。显然，从经历多年的在各种宿主系统中的重组表达所获得的结果看， 以及从在W0 99/15676中的本领域顶级专家给出的明确评估来看，昆虫宿主细胞中的杆状 病毒表达系统被认为是重组制备有活性的C因子蛋白的金标准。
【发明内容】
[0013] 本发明提供一种重组制备来自鲎的C因子蛋白的新方法，所述方法使用表达所述 C因子蛋白的寄生原生动物。具体地，本发明提供含有编码鲎C因子蛋白的多聚核苷酸的寄 生原生动物宿主细胞以及制备C因子蛋白的方法，所述方法包括在使得所述细胞表达所述 鲎C因子蛋白的条件下培养所述寄生原生动物宿主细胞。此外，本发明提供由所述新方法 制备的重组C因子蛋白和它在内毒素的检测和/或清除中的应用。
[0014] 具体地，本发明的方面为：
[0015] (1) -种寄生原生动物，其特征是含有编码C因子蛋白的多聚核苷酸。
[0016] (2)根据（1)的寄生原生动物，其中所述多聚核苷酸由引入至寄生原生动物宿主 细胞的核酸分子组成，优选为由引入至寄生原生动物宿主细胞的载体组成。
[0017] (3)根据（1)或（2)的寄生原生动物，其中所述寄生原生动物为锥体虫目下的成 员。
[0018] (4)根据（1)至（3)任一项所述的寄生原生动物，其中所述寄生原生动物为利什曼 虫属的成员。
[0019] (5)根据（1)至（4)任一项所述的寄生原生动物，其中所述寄生原生动物为蜥蜴利 什曼原虫（Leishmania tarentolae) 〇
[0020] (6)根据（1)至（5)任一项所述的寄生原生动物，其中所述多聚核苷酸编码来 自美洲豐（Limulus polyphemus)、圆尾豐（Carcinoscorpius rotundicauda)、中国豐 (Tachypleus tridentatus)或南方豐（Tachypleus gigas)的 C 因子蛋白。
[0021] (7)根据（1)至（6)任一项所述的寄生原生动物，其中所述多聚核苷酸编码具有 SEQ ID No:4的氨基酸序列的C因子蛋白。
[0022] (8) -种制备C因子蛋白的方法，其包括步骤：（a)在使得细胞表达由所述多聚核 苷酸编码的C因子蛋白的条件下培养（1)至（7)任一项所述的寄生原生动物；和（b)从细 胞培养物中回收在步骤（a)制备的C因子蛋白。
[0023] (9)根据（7)或⑶所述的方法，其中所述C因子蛋白在细胞培养基中积累。
[0024] (10)根据⑶或（9)的方法，其中制备的C因子蛋白在结合内毒素时呈现出丝氨 酸蛋白酶活性。
[0025] (11)由（8)的方法获得的C因子蛋白。
[0026] (12)由⑶至（10)任一项所述的方法制备的C因子蛋白在内毒素检测方法或在 内毒素清除方法中的用途。
[0027] (13) (11)的C因子蛋白在内毒素检测方法或在内毒素清除方法中的用途。
[0028] (14)用于内毒素检测或内毒素清除的分析或试剂盒，其包含由⑶至（10)任一项 所述的方法制备的C因子蛋白，或（11)的C因子蛋白。
[0029] (15) -种产生制备C因子蛋白的寄生原生动物宿主细胞的方法，其包括步骤： (a)将含有编码C因子蛋白的多聚核苷酸的核酸分子，优选为载体，引入至寄生原生动物， 优选为锥体虫目的寄生原生动物，更优选为利什曼虫属的成员，最优选为蜥蜴利什曼原虫 (Leishmania tarentolae);和（b)选择一个或多个在步骤（a)制备的表达所述C因子蛋白 的宿主细胞。
[0030] (16)由（15)的方法获得的寄生原生动物宿主细胞，其包含编码C因子蛋白的多聚 核苷酸，其中所述多聚核苷酸由引入至寄生原生动物宿主细胞的核酸分子（优选为载体） 组成。
【附图说明】
[0031] 图1 :显示了在37°C下底物转换15分钟后测得的依赖于rFC浓度的LPS激活的重 组C因子（rFC)的rfu值的图。用于计算比活的rFC浓度被标示出。
【具体实施方式】
[0032] 充分建立了用于在内毒素的检测和清除中使用的来源于鲎的C因子。在过去人们 尝试了通过重组表达制备作为传统的变形细胞溶解物（来源于鲎的血细胞（变形细胞）的 水提取物）的可替代来源的C因子。本领域中关于C因子的重组表达的许多尝试都失败了， 因为在各种宿主细胞中制备的重组C因子（rFC)没有表现出在内毒素检测方法中使用所需 要的生物活性。本领域所采用的宿主细胞为原核细胞、简单的真核细胞以及更高等的真核 细胞，并且在数年的集中研宄后，本领域的专家推断在昆虫细胞中的表达，而不是在原核或 简单的真核表达系统中的表达，适合于制备具有完全生物活性的rFC。与此相关的，本领域 的专家解释鲎和昆虫属于相同的门一一节肢动物门，因而在它们的生理和生化上，昆虫细 胞比酵母细胞可能更近似于鲎的细胞。因此，在昆虫细胞中制备的rFC可能更近似于从鲎 纯化的蛋白，并且保留了具有被LPS激活的丝氨酸蛋白酶活性的生物活性。
[0033] 本发明提供一种重组制备来源于鲎的C因子蛋白的新方法，所述方法使用表达所 述C因子蛋白的寄生原生动物。具体地，本发明提供含有编码来源于鲎的异源C因子蛋白 的多聚核苷酸的寄生原生动物宿主细胞，以及制备来源于鲎的重组C因子蛋白的方法，所 述方法包括在使得所述细胞表达所述重组C因子蛋白的条件下培养所述寄生原生动物宿 主细胞。此外，本发明提供由所述新方法制备的重组C因子蛋白以及它在内毒素的检测和 /或清除中的用途。
[0034] 原生动物是简单的单细胞真核有机体。本发明的主题对于技术人员来说是非显而 易见的，因为，如在上文所解释的，本领域已指引远离了使用简单的真核表达系统来成功制 备有活性的C因子蛋白。另外，令人惊讶的是，原生动物的基本伴侣系统提供重组C因子的 正确折叠，注意的是，为了得到C因子蛋白，多于20个二硫键必需被适当地连接。人们不能 预期本发明的原生动物宿主细胞提供重组的鲎C因子，该原生动物宿主细胞使得前酶原和 酶原正确裂解成由重（H)链和轻（L)链组成的有活性的蛋白酶。另外，使用由本发明提供 的原生动物表达重组鲎C因子蛋白具有如下优势：
[0035] 首先，由于需要昂贵的专用培养基的事实，使用昆虫细胞重组制备C因子蛋白的 成本高，而使用原生动物是廉价的，因为所需要的培养基是便宜的，并且设备和培养条件与 细菌的发酵相似。此外，原生动物的培养是生长相对快的（快的增代时间），并且易于按比 例增加。另外，一旦被克隆，重组表达宿主是稳定的，并且不需要连续制备传染性病毒库。在 本发明的原生动物培养物中制备的重组C因子蛋白已显示出以好的产量和可溶形式被分 泌，并且能容易地从培养物上清液中纯化。具体来说，只有一种活性形式的C因子从上清液 中纯化得到，没有降解产物。值得注意的是，所表达的重组蛋白是稳定的，并且不需要添加 剂来保护酶原形式。
[0036] 宿主细胞
[0037] 本发明提供一种寄生原生动物，其特征在于含有编码异源C因子蛋白的多聚核苷 酸。由本发明提供的寄生原生动物被用于重组制备来源于鲎的C因子。因此，本发明提供 一种用于重组制备鲎C因子的寄生原生动物宿主细胞，其中所述寄生原生动物宿主细胞的 特征在于含有编码异源C因子蛋白的多聚核苷酸。
[0038] 本发明的用于重组制备鲎C因子的宿主细胞为寄生原生动物宿主细胞。优选地， 所述寄生原生动物宿主细胞为动质体寄生原生动物宿主细胞。这些宿主细胞的共有分类 学特征为具有浓密核外DNA的单一线粒体。含有所述DNA的线粒体区域被称为"动质体"， 所述DNA被称为"动质体DNA"。小亚基rRNA-基础和保守的蛋白质基础的种系发生支持 了动质体分裂成 5 个目：原动质体目（Prokinetoplastida)、Neobodonida、Parabodonida、 Eubodonida和锥体虫目（Trypanosomatida)。因此，本发明的优选的动质体寄生原生动物 为寄生的原动质体目（Prokinetoplastida)、Neobodonida、Parabodonida、Eubodonida 或 锥体虫目（Trypanosomatida)。优选地，本发明的动质体寄生原生动物为寄生锥体虫（即， 寄生锥体虫目）。由于锥体虫的所有成员为寄生的，本文简单地用术语"锥体虫"来描述寄 生锥体虫（即，寄生锥体虫目）。
[0039] 锥体虫由单性生殖属（比如短膜虫属（Crithidia)、细滴虫属（Leptomonas)和 Blastocrithidia和复殖属（比如利什曼虫属和锥体虫属）组成。在本发明中，优选的动 质体寄生原生动物为复殖的锥体虫（即，锥体虫目的复殖成员）。更优选地，本发明的宿主 细胞为利什曼虫属的成员。更优选地，本发明的宿主细胞为硕大利什曼原虫（Leishmania major)或蜥蜴利什曼原虫（Leishmania tarentolae)。在本发明中，最优选的宿主细胞为蜥 蜴利什曼原虫。在多种实施方式中，本发明的宿主细胞为锥体虫属的成员。在优选的实施 方式中，本发明的宿主细胞选自布氏锥虫（Trypanosoma brucei)和提氏锥虫（Trypanosoma theileri)〇
[0040] 虽然锥体虫为人和动物疾病的重要起因，但是许多种类是非致病性的。本发明的 锥体虫原生动物优选为非致病性的动质体寄生原生动物（非致病性的动质体目），更优选 为非致病性的锥体虫原生动物（非致病性的锥体虫科），更优选的为非致病性的利什曼虫 属。优选的动质体目的非致病性的种类包括（但不限于）蜥蜴利什曼原虫（Leishmania tarentolae)、束形短膜虫(Crithidia fasciculata)、Wallaceina inconstans (从前 的 Proteomonas inconstans)、Leptomonas collos、Leptomonas sp.和 Leptomonas seymouri。本发明最优选的非致病性的原生动物为蜥蜴利什曼原虫。在多种实施方式中， 本发明的寄生原生动物宿主细胞为减弱的致病性原生动物宿主细胞，即，它们的致病性已 被减弱了。优选为遗传减弱的。减弱病原体的一种方法为目标基因的删除。因此，遗传减 弱的锥体虫寄生物（即，锥体虫寄生原生动物）能通过选择的基因（如，编码毒力因子的基 因）的删除获得。基因删除利用了该寄生物能经历内源和人工引入到细胞中的外源DNA序 列间的同源重组的事实。在本发明中所用的减弱的寄生原生动物（优选为减弱的锥体虫寄 生物）具有减弱的毒力，特别是对人的减弱的毒力。
[0041] 应当理解的是，贯穿说明书和权利要求书，像"非致病性的动质体目"或"非致病 性的锥体虫科"的术语的使用涉及的不只是包含在前述种类中的有机体/宿主，也包括那 些可替代分类学体系中的那些种类，这些种类具有上面定义的同样的形态和培养特性或特 征，并且可以是"非致病性的动质体目"和"非致病性的锥体虫科"的同义词。
[0042] 如在本文中所用的，术语非致病性包括（但不限于）对人非致病性的意思。在多 种实施方式中，"非致病性"由正在讨论的有机体分类学定义为生物安全等级1级。
[0043] 在多种实施方式中，所述原生动物宿主细胞包含选择标记，优选为选择标记基因。
[0044] 表达系统
[0045] 本发明提供含有编码来源于鲎的异源C因子蛋白的多聚核苷酸的原生动物宿主 细胞。如在本文中所用的，异源蛋白是指对宿主细胞来说是非天然的蛋白。本发明的原生 动物宿主细胞代表重组制备鲎C因子蛋白的表达系统。因此，本发明提供包含寄生原生动 物宿主细胞和编码来源于鲎的异源C因子蛋白的多聚核苷酸的表达系统，也提供所述表达 系统在来源于鲎的异源C因子蛋白的表达中的用途。虽然在多种实施方式中，本发明提供 的表达系统可以包含作为分离方式的宿主细胞和多聚核苷酸，优选地，由本发明提供的表 达系统包含寄生原生动物宿主细胞，其已经含有编码异源鲎C因子蛋白的多聚核苷酸。
[0046] 在多种实施方式中，编码异源鲎C因子蛋白的多聚核苷酸可操作地连接到合适的 启动子序列上，并且（如果合适）连接到转录后信号序列，所述转录后信号序列能够指导编 码C因子蛋白的多聚核苷酸在本发明的宿主细胞中表达。优选地，所述启动子为动质体寄 生原生动物的活跃转录的基因的启动子。更优选地，所述启动子为锥体虫目的成员的活跃 转录的基因的启动子；更优选地，所述启动子为利什曼虫属的成员的活跃转录的基因的启 动子；最优选地，所述启动子为蜥蜴利什曼原虫的活跃转录的基因的启动子。
[0047] 在多种实施方式中，所述启动子为强转录起始异源启动子。
[0048] 在本发明中所用的编码鲎C因子蛋白的多聚核苷酸为异源多聚核苷酸，具体为编 码异源鲎C因子蛋白的异源多聚核苷酸。如在本文中所用的，异源多聚核苷酸指对于宿主 细胞来说不是天然的多聚核苷酸。在多种实施方式中，在本发明中所用的异源多聚核苷酸 的转录由与被包含的和被表达的阻遏基因相连的阻遏应答元件控制。
[0049] 在多种实施方式中，至少一个拷贝的所述异源多聚核苷酸被置于本发明的原生动 物宿主细胞的活跃转录的基因簇中。优选地，所述活跃转录的基因簇为rRNA基因簇。
[005