专利名称：核因子tdrp1的克隆、蛋白表达、多抗制备以及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及新型核因子TDRPl的基因克隆、基因表达、蛋 白纯化、多克隆抗体制备、以及TDRPl的功能探讨。
背景技术：
生殖和发育是生物体物种得以延续的基础，睾丸是雄性动物的生殖器官，是雄激 素和精子产生及成熟的场所。精子在睾丸中的发生和发育成熟既是物种遗传物质得以延 续的基础，也是生殖的重要内容。精子的发生和成熟是一个极其复杂的过程，经过一次有 丝分裂和两次减数分裂，一个精原细胞最终演变成四个单倍体的精子细胞，精子细胞历经 顶体形成、核浓缩、鞭毛发育以及胞质的丢失等过程，最后变成成熟的精子。精子发生和 成熟是一个受严格调控的过程，不同时期在不同的生精细胞会表达不同的基因和蛋白，譬 如PH-30和PH-20基因在所有的生精细胞表达[1] [2]，阳离子依赖的6-磷酸甘露糖受体 (M6pr)基因主要表达于精母细胞和精子细胞[3]，而纤维鞘蛋白1 (Fscl)、层粘连蛋白受体 (Mlr)以及细胞色素Cs (Cytcs)等基因只在精子细胞表达。近年来，一大批与睾丸发育或精子发生有关的新基因被陆续克隆出，在这方面， 我国的科研工作者做出了不懈的努力，他们克隆出了 LM23、TSARG2、MSRG-IU NHEDCU NYD-SP15,Pkd212,SPATA12,TSAP,Tsc24,TSC77, UbeU CKLFSF2, AEPU Znf313 等与睾丸发 育或精子发生有关的新基因，并初步研究研究了它们的功能[7-20]。国外的一些研究小组， 应用基因剔除动物模型，深入而明确地研究了某些与睾丸发育或精子发生有关的基因。研 究发现，CIBU Ant4,PATZU SirtUcyclin Al、Hsp70_2、Trf2 以及 Siahla 等基因剔除的雄 性小鼠都出现了不育，有的还伴有生殖细胞的调亡和睾丸的缩小[21-28]。相关参考文献1, Wolfsberg TG, Bazan JF, Blobel CP, Myles DG, Primakoff P, White JM. Theprecursor region of a protein active in sperm-egg fusion contains a metalloproteaseand a disintegrin domain structural,functional,and evolutionary implications. ProcNatl Acad Sci U S A. 1993Nov 15 ；90 (22) :10783-7.2、 Lin Y, Mahan K, Lathrop WF, Myles DG, Primakoff P. A hyaluronidase activity ofthe sperm plasma membrane protein PH-20 enables sperm to penetrate the cumuluscell layer surrounding the egg. J Cell Biol. 1994 Jun ； 125(5) :1157-63.3、0 ' Brien DA, Welch JE, Fulcher KD, Eddy EM. Expression of mannose 6-phosphatereceptor messenger ribonucleic acids in mouse spermatogenic and Sertoli cells.BiolReprod. 1994Feb ；50(2) :429-35.4、 Fulcher KD, Mori C, Welch JE, 0 ' Brien DA, Klapper DG, Eddy EM. Characterization of Fscl cDNA for a mouse sperm fibrous sheath component. BiolR印rod. 1995Jan ；52(1) :41-9.5、Fulcher KD, Welch JE, Davis CM, 0' Brien DA, Eddy EM. Characterizationoflaminin receptor messenger ribonucleic acid and protein expression in mousespermatogenic cells.Biol Reprod. 1993Mar ；48 (3) :674-82.6、Hake LE, Hecht NB. Utilization of an alternative transcription initiation site ofsomatic cytochrome c in the mouse produces a testis—specific cytochrome c mRNA. JBiol Chem. 1993 Mar 5 ；268 (7) :4788-97.7、 Liu ML, Pei KY, Shi XQ, Liu DY， Jia MC. Identification and characterization of anovel spermatogenesis related gene LM23 in rat testis. Biochem Biophys ResCommun. 2007May 11 ；356(3) :576-81.8、 Liu SF, Lu GX, Liu G， Xing XW, Li LY, Wang Z (2004) Cloning of a full—lengthcDNA of human testis—specific spermatogenic cell apoptosis inhibitor TSARG2as acandidate oncogene. Biochem Biophys Res Commun 319，32—40·9、 Deng Y， Nie DS, Wang J, Tan XJ, Nie ZY, Yang HM, Hu LS, Lu GX(2005)Molecularcloning of MSRG-11 gene related to apoptosis of mouse spermatogeniccells. Acta Biochim Biophys Sin 37，159—166.10、Ye G，Chen C，Han D，Xiong X，Kong Y,Wan B，Yu L Cloning of a novelhuman NHEDCl(Na+/H+exchanger like domain containing 1)gene expressedspecifically in testis. Mol Biol Rep. 2006 Sep ；33 (3) :175-80.11、Liu Q，Liu J，Cao Q，Sha J，Zhou Z，Wang H，Li J. NYD_SP15:a novel genepotentialIy involved in regulating testicular development and spermatogenesis. Biochem Genet. 2006 Oct ；44 (7-8) :409-23.12、Chen YiZhang Z，Lv XYiWang YDiHu ZGiSun H，Tan RZiLiu YHiBian GHiXiao Y，Li QW,Yang QTiAi JZiFeng LiYang YiWei YQ,Zhou Q. Expression ofPkd212 in testis is implicated in spermatogenesis. Biol Pharm Bull. 2008Aug ；31 (8) :1496-500.13、Dan L， Lifang Y， Guangxiu L.Expression and possible functions of a novel geneSPATA12 in human testis.J Androl. 2007 Jul-Aug ；28 (4) :502-12.14、 Bin L, Gang W, Hu J, Gong W， Yue M， Song P. Identification andcharacterization of TSAP, a novel gene specifically expressed in testis duringspermatogenesis. Mol Reprod Dev. 2007Sep ；74 (9) :1141-8.15、Tang A，Yu Z，Gui Y，Guo X，Long Y，Cai Z. Identification and characteristics ofa novel testis—specific gene，Tsc24，in human and mice. Biol Pharm Bull. 2006Nov ；29 (11) :2187-91.16、Tang A，Yu Z，Gui Y，Zhu H，Long Y，Cai Z. Identification of a noveltestis-specific gene in mice and its potential roles in spermatogenesis. Croat Med J. 2007Feb ；48(1) :43-50.17、DU Y，Liu ML，Jia MC. Identification and characterization of aspermatogenesis-related gene Ubel in rat testis.Sheng Li Xue Bao. 2008 Jun25 ； 60(3) :382-90.18、Liu G，Xin ZC，Chen L，Tian L，Yuan YM，Song WD, Jiang XJ，Guo YL. Expression and localization of CKLFSF2 in human spermatogenesis. Asian JAndrol. 2007 Mar ；9 (2) :189-98.19,Luk Jl,Lee NP,Shum CK,Lam BY,Siu AF,Che CM,Tam PC,Cheung AN,Yang ZM, Lin YN, Matzuk MM, Lee KF, Yeung WS. Acrosome-specific gene AEPl identification, characterization and roles in spermatogenesis. J Cell Physiol. 2006Dec；209(3) 755-66.20、Li N,Sun H,Wu Q,Tao D,Zhang S,Ma Y.Cloning and expression analysis of anovel mouse zinc finger protein gene Znf313 abundantly expressed in testis. JBiochem Mol Biol. 2007 Mar 31 ；40 (2) :270-6.21、Yuan W, Leisner TM, McFadden AW, Clark S, Hiller S, Maeda N, 0' Brien DA,Parise LV. CIBl is essential for mouse spermatogenesis. Mol Cell Biol. 2006Nov ； 26(22) :8507-14.22、 Brower JV, Rodic N, Seki Τ, Jorgensen Μ, Fliess N, Yachnis AT, McCarrey JR, Oh SP, Terada N.Evolutionarily conserved mammalian adenine nucleotidetranslocase 4 is essential for spermatogenesis. J Biol Chem.2007 0ct5 ；282 (40) :29658-66.23、Fedele Μ, Franco R, Salvatore G, Paronetto MP, Barbagallo F, Pero R, ChiariottiL,Sette C,Tramontano D,Chieffi G,Fusco A,Chieffi P.PATZl gene has a criticalrole in the spermatogenesis and testicular tumours. J Pathol. 2008 May ； 215(1) :39-47.24、 Coussens Μ, Maresh JG, Yanagimachi R, Maeda G, Allsopp R.Sirtl deficiencyattenuates spermatogenesis and germ cell function. PLoS ONE. 2008 Feb 13 ；3 (2) :el571.25、Liu D, Matzuk MM, Sung WK, Guo Q, Wang P& Wolgemuth DJ 1998 CyclinAl is required for meiosis in the male mouse. Nature Genetics 20377—380.26、Dix DJ, Allen Jff, Collins Bff, Mori C, Nakamura N, Poorman-Allen P, Goulding EH & Eddy EM 1996 Targeted gene disruption of Hsp70_2 results in failedmeiosis, germ cell apoptosis, and male infertility. Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America 93 3264-3268.27、 Zhang D, Penttila TL, Morris PL, Teichmann M & Roeder RG 200ISpermiogenesis deficiency in mice lacking the Trf2 gene.Science 292 1153-1155.28、 Dickins RA, Frew IJ, House CM, O， Bryan MK, Holloway AJ, Haviv I， TraficanteN, de Kretser DM & Bowtell DD 2002 The ubiquitin ligase component Siahla isrequired for completion of meiosis I in male mice. Molecular and Cellular Biology 222294-2303.
发明内容
本发明的目的是提供一个新型核因子TDRP1。本发明的另一个目的是提供新型核因子TDRPl的制备方法。
本发明的目的是提供新型核因子TDRPl的应用。本发明根据生物信息学及分子生物学的分析结果，应用基因工程及蛋白质工程进 行蛋白质的表达及纯化和多克隆抗体的制备。包括表达全长TDRPl编码序列的蛋白质，在 合适的表达载体中克隆包括表达全长TDRPl编码序列，用该载体转染宿主细胞，在适于表 达该DNA片断的条件下培养该宿主细胞，以及从培养物中回收及纯化所需TDRPl蛋白。2004年，公开了人胰岛素瘤组织的基因表达谱(Wang XC, et al. Endocr-Relat Cancer, 2004 ；11 (2) :295-303.)。本发明从人胰岛素瘤组织中克隆到一个新基因，将其命 名为睾丸发育相关蛋白(Iestis Development RelatedProtein, TDRP) 人类 TDRP 基因 染色体定位于8p23，大小为55. 03Kb，有两个不同的转录本，大小分别是3. 2Kb和2. 4Kb。 3. 2Kb的转录本(TDRPl)有3个外显子，编码序列包含M9bp，编码183个氨基酸残基的蛋 白。2. 4Kb的转录本(TDRP》是由3. 2Kb转录本的第3号外显子剪切掉788个核苷酸而产 生，其包含4个外显子，完全读码框有594个核苷酸，编码198个氨基酸的蛋白。TDRPl和 TDRP2蛋白它们5，端的163个氨基酸是相同的。Northern blotting和RT-PCR都检测到在 人的睾丸组织存在这两个转录本，并且发现TDRPl是TDRP基因的主要转录本，因此本研究 的重点放在TDRPl转录本上。PCR产物亚克隆至pDrive载体后，测序证实了两个转录本的 核酸序列。应用 NetNES 1. 1 软件(http //www. cbs. dtu. dk/services/NetNES/)发现 TDRP 分子内含有明显的亮氨酸丰富的核输出序列。以SD大鼠为动物模型，应用Northern blotting建立了大鼠Tdrp基因的组织表 达谱，发现Tdrp基因主要表达于睾丸组织，并且表达量极其丰富，在肾脏和脂肪组织也有 少量的表达。结果还发现大鼠Tdrp基因也存在两个不同的转录本，同人TDRP基因的3. 2Kb 和2. 4Kb转录本相似，并且较大的转录本(Tdrpl)是主要的转录本。应用原核表达载体 PGEX-4T-2表达纯化了 GST-TDRP1融合蛋白，免疫家兔后得到了 TDRPl的多克隆抗体。免 疫组化方法研究了 TDRPl在大鼠睾丸组织中的细胞定位，发现TDRPl表达在生精细胞，具体 地讲，TDRPl主要表达于精母细胞，在精原细胞和精子细胞也有少量的表达。而在赖迪细胞 (Leydigcell)和塞托利细胞(Sertoli cell)无表达。同时发现，TDRPl能够表达在某些生 精细胞的细胞核。对来源于小鼠睾丸组织的某些细胞株的研究也证实了上述结果，Tdrpl基 因和蛋白在精原细胞株GC-I spg和精母细胞株GC-2 spd中有表达，而在赖迪细胞株TM3 和塞托利细胞株TM4无表达。将TDRPl基因的编码序列克隆至pEGFP-C2载体中，并转染 HeLa细胞，激光共聚焦研究发现GFP-TDRP1融合蛋白分布于胞浆和胞核；同时免疫荧光研 究也发现，HeLa细胞中内源性的TDRPl在胞浆和胞核都有表达。分别抽提胞浆和胞核蛋白 后，Western blotting研究发现，无论在转染了 TDRPl基因的HeLa细胞核，还是成年大鼠 睾丸组织的细胞核抽提物，均能检测到TDRPl的表达。上述研究提示，TDRPl是一个新型的 在睾丸生精细胞表达丰富的核因子。对不同发育年龄大鼠的研究发现，Tdrpl基因和蛋白在新生的大鼠睾丸组织表达 量极低，随着年龄的增加，表达量上升，在出生后2个月(性发育成熟)时达到高峰，以后随 着年龄的老化，表达量略有下降。提示TDRPl的作用可能与睾丸发育或精子发生有关。另 外，蛋白水平的研究还发现，随着大鼠性发育的成熟，TDRPl在细胞核中的表达越来越多，提 示TDRPl的入核对于睾丸发育或精子发生具有重要作用。应用酵母双杂交系统，筛选到7 个可以与TDRPl相互作用的蛋白，RANBP9是其中一个可以与TDRPl相互作用的蛋白，这一作用已通过GST pull down和免疫共沉淀等实验证实，由于已有研究证实，RANBP9可以与雄 激素受体相互作用，激活雄激素受体的转录活性。因此，我们推测TDRPl通过与RANBP9结 合后，调节雄激素受体的转录活性，从而在精子发生或睾丸发育过程中发挥重要作用。本发明提供了一种核因子TDRP1，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。其核苷酸序 列如 SEQ ID NO 1 所示。SEQ ID NO 2(TDRP1 的氨基酸序列)MWKLGRGRVLLDEPPEEEDGLRG GPPPAAAAQAQVQGASFRGWKEVTSLFNKDDEQHLLERCKSPKSKGTNLRLKEELKAEKKSGFWDNLVLKQNIQSKK PDEIEGffEPPKLALEDISADPEDTVGGHPSWSGWEDDAKGSTKYTSLASSANSSRWSLRAAGRLVSIRRQSKGHLTD SPEEAE。本发明的核因子TDRP1，还包括具有相同转录因子功能的、SEQ ID NO 2的变异形 式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地 1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加 一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在 本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如， 在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。编码核因子TDRPl的多核苷酸序列选自序列表SEQ ID NO 1中的81-6 位。在 本发明中，核因子TDRPl的多核苷酸编码序列也包括简并序列。简并序列是指，有一个或多 个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性， 所以与SEQ ID NO :1中的81-6 位核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码出 SEQ ID NO. 2所述的序列。所述的核因子TDRPl的制备方法，可以按照SEQ ID NO 2的氨基酸序列人工合 成。也可以利用常规方法，将核因子TDRPl从人的细胞或者组织(例如人胰岛素瘤组织) 中分离纯化。或者将编码核因子TDRPl的多核苷酸序列克隆到表达载体，转入宿主细胞 表达，最终分离纯化获得核因子TDRPl蛋白。例如，采用原核载体PGEX-4T-2，宿主可以是 ROSSET(DE3)或 BL21(DE3)。本发明中，TDRPl基因的制备包括经PCR反应后进行纯化，核苷酸序列分析验证基 因是否正确。本发明全长TDRPl基因编码序列的扩增不限定特定的DNA聚合酶。在一优选 实施方案中，本发明使用CL0NTECH公司的Advantage GC2PCR试剂盒。本发明还提供了含有TDRPl基因的核苷酸编码序列的克隆载体或者表达载体。通 常可以将TDRPl基因的核苷酸编码序列插入市售的克隆载体或者表达载体的多克隆位点 而得。例如，采用原核载体PGEX-4T-2。本发明还提供了上述核因子TDRPl的多克隆抗体。该多克隆抗体可以按照本领域 的常规方法获得，也可以按照下述具体方法制备(1)获得全长编码序列基因；(2)将基因与原核表达载体重组；(3)将重组表达载体转导原核表达系统；(4)用ImM IPTG诱导TDRPl的表达，表达后的TDRPl经谷胱甘肽亲和层析加以纯 化，并用凝血酶从融合蛋白中切除GST标签获得纯化好的TDRPl蛋白；(5)纯化后的TDRPl免疫新西兰白兔，获得TDRPl多克隆抗体血清。可以利用Wfestern blotting方法鉴定TDRPl多克隆抗体的质量和滴度。
将本发明的全长TDRPl编码序列的DNA与表达载体重组，形成重组表达质粒。本 发明不限定特定的表达质粒。在一优选实施方案中，本发明使用原核表达载体PGEX-4T-2。同时将上述重组原核表达载体克隆按常规方法导入适宜原核宿主细胞。本发明 不限于特定的宿主细胞，只要它能够表达所述重组表达载体。所述的原核表达系统可以是 ROSSET (DE3)或BL21(DE3)。在一优选方案中，本发明使用大肠杆菌ROSSET (DE3)等。本发明的表达产物以包涵体的形式存在于宿主细胞的胞体中，破解分离包涵体， 高浓度尿素溶解包涵体，分离纯化TDRP1，将纯化后蛋白进行SDS-PAGE电泳，凝胶放入考马 斯亮兰染液染色、脱色之后，用无菌手术刀片割下含有TDRPl蛋白的目的条带。本发明采用新西兰大白兔作为免疫动物。将含有TDRPl蛋白的凝胶碾碎，与弗氏 完全佐剂乳化，多次注射免疫兔子，末次免疫后心脏采血，分离出免疫血清，采用Western Blot方法检测抗体的质量和滴度。本发明利用制备好的TDRPl多克隆抗体采用免疫组化方法研究了 TDRPl在大鼠睾 丸组织中的细胞定位，发现TDRPl主要表达于精母细胞，在精原细胞和精子细胞也有少量 的表达，而在赖迪细胞(Leydig cell)和塞托利细胞(krtolicell)无表达，同时免疫组化 还发现TDRPl可以在生精细胞的细胞核表达。本发明将TDRPl基因的编码序列克隆至PEGFP-C2载体中，并转染HeLa细胞，激光 共聚焦研究发现GFP-TDRP1融合蛋白分布于胞浆和胞核；同时免疫荧光研究也发现，HeLa 细胞中内源性的TDRPl在胞浆和胞核都有表达。分别抽提胞浆和胞核蛋白后，Western blotting研究发现，无论在转染了 TDRPl基因的HeLa细胞核，还是成年大鼠睾丸组织的细 胞核抽提物，均能检测到TDRPl的表达。上述研究提示，TDRPl是一个新型的核因子。新型核因子TDRPl在精子发生或睾丸发育过程中发挥重要作用。本发明对不同发育年龄大鼠的研究发现，Tdrpl基因和蛋白在新生的大鼠睾丸组 织表达量极低，随着年龄的增加，表达量上升，在出生后2个月(性发育成熟)时达到高峰， 以后随着年龄的老化，表达量略有下降。提示TDRPl的作用可能与睾丸发育或精子发生有 关。另外，蛋白水平的研究还发现，随着大鼠性发育的成熟，TDRPl在细胞核中的表达越来 越多，提示TDRPl的入核对于睾丸发育或精子发生具有重要作用。 本发明应用酵母双杂交系统，筛选到7个可以与TDRPl相互作用的蛋白，RANBP9是 其中一个可以与TDRPl相互作用的蛋白，这一作用已通过GST pull down和免疫共沉淀等 实验证实，由于已有研究证实，RANBP9可以与雄激素受体相互作用，激活雄激素受体的转录 活性。因此，我们推测TDRPl通过与RANBP9结合后，可以调节雄激素受体的转录活性。以上技术方案中所有基本分子生物学操作技术均参照《分子克隆第三版》。本发明应用基因工程方法生产得到特异性好、高效和高质量的TDRPl多克隆抗 体，为进一步探讨TDRPl的生理功能及其作用机制打下了基础。同时利用分子生物学方法 初步揭示了 TDRPl的功能，提示TDRPl在精子发生或睾丸发育过程中发挥重要作用，为未来 不育症的治疗提供新的途径。本发明首次克隆到了一个新型核因子-TDRP1，表达纯化了 TDRPl蛋白，制备了 TDRPl多克隆抗体。免疫组化显示，TDRPl在睾丸组织主要表达于生精细胞。激光共聚焦、 免疫荧光以及Astern blotting等实验显示，TDRPl能够表达在细胞核，提示TDRPl为一 个核因子。对不同发育年龄大鼠的研究发现，Tdrpl基因和蛋白在新生的大鼠睾丸组织表达量极低，至出生后3周，表达量明显上升，在出生后2个月(性发育成熟)时达到高峰，以 后随着年龄的老化，表达量略有下降。另外，蛋白水平的研究还发现，随着大鼠性发育的成 熟，TDRPl在细胞核中的表达越来越多，提示TDRPl的入核对于睾丸发育或精子发生具有重 要作用。应用酵母双杂交系统，筛选到7个可以与TDRPl相互作用的蛋白，RANBP9是其中 一个可以与TDRPl相互作用的蛋白，这一作用已通过GST pull down和免疫共沉淀等实验 证实，我们推测TDRPl与RANBP9结合后，调节雄激素受体的转录活性，从而在精子发生或睾 丸发育过程中发挥重要作用，对TDRPl功能的进一步研究可能对未来不育症的治疗提供新 的靶点。
具体实施例方式实施例ITDRPl原核表达载体的构建将含有全长TDRPl基因编码序列的DNA片段与pGEX_4T_2进行双酶切(BamHI和 Sal I)，用T4连接酶进行连接，建立TDRPl原核表达载体。将重组载体pGEX_4T-2_TDRPl 转化大肠杆菌ROSSET (DE3)，氨苄青霉素培养基筛选阳性菌株，扩增提取质粒酶切鉴定和测 序证实序列正确。实施例2TDRP1的表达挑单克隆菌落接种至5ml YTA medium，37°C X 250rpm 至 0D600 = 1-2，接种至 500ml YTA medium，37°C X 250rpm 至 0D600 = 1-2，加 IM IPTG 至终浓度 ImM，25°C 诱导表达 3h, 4°C 4000rpm 20min,收集菌体，超声裂解细菌并离心，将上清和沉淀(0. 01 % PBS溶解) 分别用5X上样缓冲液混合后，作SDS-PAGE电泳，考马斯亮兰染色后，可见诱导后沉淀中在 分子量约47Kd处有一浓集条带，而上清中表达量低。提示TDRPl蛋白表达在包涵体中。实施例3 TDRPl蛋白的纯化将诱导后全菌离心，用BugBuster (Novagen公司)和超声裂解细菌，再次离心，离 心后沉淀用含有8M尿素的1 Xbinging buffer溶解，溶解的上清用Thermo公司的B-PER 细菌GST标签融合蛋白柱式纯化试剂盒，得到纯化好的GST-TDRP1融合蛋白，用凝血酶从 融合蛋白中切除GST标签，蛋白酶解后，GST载体和蛋白酶通过谷胱甘肽琼脂糖亲和层析去 除，最后得到纯化好的TDRPl蛋白。实施例4TDRP1多克隆抗体制备将上述纯化的TDRPl蛋白进行SDS-PAGE电泳，将凝胶放入考马斯亮兰染液进行染 色约4小时，取出凝胶放入脱色液中进行脱色约4 8小时，用无菌手术刀片割下所需的目 的条带，IXPBS洗涤2次，4°C保存备用。采用新西兰大白兔作为免疫动物。白兔作免疫接种 前采集血样以作阴性对照。将约含有IOOugTDRPl蛋白的凝胶碾碎，与弗氏完全佐剂乳化， 在白兔背部刮毛后，分散M-36位点注射，初次免疫后在4、7、9、11周分别以等量的抗原与 弗氏不完全佐剂乳化后加强免疫。末次免疫后心脏采血，用Western Blot方法检测抗体效 价。末次免疫后第10天颈动脉放血，分离出免疫血清，免疫血清加NaN3至终浓度0. 02%， 分装于1. 5ml离心管，-80°保存备用。采用Western Blot方法检测抗体滴度和质量。实施例5TDRP1功能的初步揭示(I)TDRPl蛋白在睾丸组织中的细胞定位制备大鼠的睾丸组织石蜡切片，免疫组化方法研究了 TDRPl在大鼠睾丸组织中的细胞定位，发现TDRPl表达在生精细胞，具体地讲，TDRPl主要表达于精母细胞，在精原细胞 和精子细胞也有少量的表达，而在赖迪细胞(Leydig cell)和塞托利细胞(Sertoli cell) 无表达。同时发现，TDRPl能够表达在某些生精细胞的细胞核。(2)TDRPl是一个新型的核因子应用NetNES 1. 1 软件(http//www. cbs. dtu. dk/services/NetNES/)发现 TDRP 分子内含有明显的亮氨酸丰富的核输出序列。将TDRPl基因的编码序列克隆至pEGFP-C2 载体中，并转染HeLa细胞，激光共聚焦研究发现GFP-TDRP1融合蛋白分布于胞浆和胞核；同 时免疫荧光研究也发现，HeLa细胞中内源性的TDRPl在胞浆和胞核都有表达。分别抽提胞 浆和胞核蛋白后，Western blotting研究发现，无论在转染了 TDRPl基因的HeLa细胞核， 还是成年大鼠睾丸组织的细胞核抽提物，均能检测到TDRPl的表达。上述研究提示，TDRPl 是一个新型的在睾丸生精细胞表达丰富的核因子。实施例6TDRP1在精子发生或睾丸发育过程中的初步功能探讨对不同发育年龄大鼠的研究发现，Tdrpl基因和蛋白在新生的大鼠睾丸组织表达 量极低，至出生后3周，表达量明显上升，在出生后2个月(性发育成熟)时达到高峰，以后 随着年龄的老化，表达量略有下降。另外，蛋白水平的研究还发现，随着大鼠性发育的成熟， TDRPl在细胞核中的表达越来越多，提示TDRPl的入核对于睾丸发育或精子发生具有重要 作用。应用酵母双杂交系统，筛选到7个可以与TDRPl相互作用的蛋白，RANBP9是其中一 个可以与TDRPl相互作用的蛋白，这一作用已通过GST pull down和免疫共沉淀等实验证 实，由于已有研究证实，RANBP9可以与雄激素受体相互作用，激活雄激素受体的转录活性。 因此，我们推测TDRPl通过与RANBP9结合后，调节雄激素受体的转录活性，从而在精子发生 或睾丸发育过程中发挥重要作用。从以上描述，本领域技术人员可很容易地理解本发明的本质特征。而且在不偏离 其主旨和范围的情况下，可对本发明进行各种变更和改进。本领域技术人员可最大限度地 应用本发明。因此，上述的优选具体实施方案应被理解为仅是举例说明，而非已以任何方式 限制本发明的范围。序列表
<210>1
<211>3273
<212>DNA
<213>Homosapiens
<220>
<221>CDS
<222>(81). (629)
<223>
<400>1
ggcagagcgtCCggCggCCgggagggacgc ggacccacag cccgacgcac ggacggaggg
acgccggagcccgcctgaccatg tgg aag ctg ggc egg ggc cga gtg ctg ctg
Met Trp Lys Leu Gly Arg Gly Arg Val Leu Leu
1 5 10
gacgagCCCCCCgaggaggaggacggcCtgCgtggggggCCgccaCCg161
AspGluProProGluGluGluAspGlyLeuArgGlyGlyProProPro
152025
gccgccgccgcccaggcgcaggttcagggagcaagtttccgaggttgg209
AlaAlaAlaAlaGlnAlaGlnValGlnGlyAlaSerPheArgGlyTrp
303540
gaagtgactteaCtgtttaacgatgatgagcagcatctcCtg257
LysGluValThrSerLeuPheAsnLysAspAspGluGlnHisLeuLeu
455055
gaaagatgttctCCCaagtccggaactaacttacgattaSlSlSl305
GluArgCysLysSerProLysSerLysGlyThrAsnLeuArgLeuLys
60657075
gaagagttgaaggcagagaagSlSlSltctggattttgggacaatttggtt353
GluGluLeuLysAlaGluLysLysSerGlyPheTrpAspAsnLeuVal
808590
ttacagaatatacagtctccagatgaaattgaaggttgg401
LeuLysGlnAsnlieGlnSerLysLysProAspGlulieGluGlyTrp
95100105
gagcctccaCttgetCttgaagacatatcggetgaccctgaggac449
GluProProLysLeuAlaLeuGluAsplieSerAlaAspProGluAsp
110115120
accgtgggtggccacccatcctggteaggctgggaggatgacgccaag497
ThrValGlyGlyHisProSerTrpSerGlyTrpGluAspAspAlaLys
125130135
ggctcgaccaagtacaccageCtggccagetctgccaacagetccagg545
GlySerThrLysTyrThrSerLeuAlaSerSerAlaAsnSerSerArg
140145150155
tggageCtgCgCgcggcagggaggCtggtgageatecgaeggcagagt593
TrpSerLeuArgAlaAlaGlyArgLeuValSerlieArgArgGlnSer
160165170
SlSlSlggccacCtgacagatageCCggaggaggcggagtgaggggggc639
LysGlyHisLeuThrAspSerProGluGluAlaGlu
175180
tgcgtggcaa gtgtgccccg acatggtggccttttatgagtataccatgt agttgttgag699
tcttttccgc gttagaaaga atagagagtctactttttgcctatatttga tatttggacc759
tctgtttctt tatttaatga actctcacacacactgtgactccttggtga acacgtgcag819
ggattgtaca tttgattgcc ttattgcagaclcltclttCclCCtatcagtcca tgttttgcag879
aaactggaga tgtgaattta tgatgctctcCCcltclcltclCclgcagtaatga tttgcagttt939
ctcacaaaat gattttcatg ctgctctgtgttgtagttctgtttcagaac ttccgtacct9990134]ttttcttgtatgtagcacgtataaatgcag0135]aattagtcaggaggtaagatgaatcttcca0136]￡1￡Ι ￡1￡1￡10 tgttcttatt3.3.3.C 3.3.3. 3-C0137]atttgggagtaaaatgtatcttaaaatgca0138]tcttgtatgtccactggatagtaacagtgg0139]ttgaacttctaaatcggtccctttattttc0140]gattaaagaagtatggatcaattttagtca0141]tgctcattatagagagttaagactgtgcat0142]ctcatatgtttgttcttgcaaagcgagatg0143]agctgtgttttttccacaagaataatcgac0144]tttctgtctgcttactgtccttgacaatgt0145]cgtccctggaaggttggctcttatcagcaa0146]tttgaaagaaaaggtatatttttctttttt0147]actgtgcattcccctcacgtaaaaacaaga0148]cactcctgtgctgtttcatgcatgtggatg0149]agtgtgcctgatggcagaacacactgcagt0150]acaggtttacttgatctgtcatctgttatg0151]tagctaaatctataatctgtgtcaatcact0152]ctgtcctctatgtctgtcttctctcagtct0153]Cttttttttttaatagaacaagaagtttac0154]aattggtgttC 3.3.3.C 3.3.3.3.3.ttccagcttg0155]aggttttctttgttccataatacagagaca0156]tgacaaattctaagtttcctcaggtaaata0157]cttgctgggatagtaaaaacatacaccatt0158]agtcagtgtaggtttgtttttggctaacat0159]gtttgaaactctggaaatcaCgtgtgtggg0160]gctctgtggctgtgatggctgcagttgccg0161]ctcacgtcaatcatagaattgtgacgcaca0162]eaaaatttgaggacaaacccagattgggat0163]tatctacaaagactaatgtaaaaatgattt0164]gtttttaata 3.3.3. 3. 3.ttggtgtgct0165]agttatcaaagcaaatttattatcttcaca0166]ggtgtttgaattgtgtaaacacacagcttc0167]tctactgtactttttttattttttaatagg0168]cttaatgttgaggtttttta0169]actgtttttaagctctttccttattggttt0170]tttaatcactcagagctaatggcacctttc0171]cacatgtagacttttcacaaataaatgaac0172]<210>2
ctgtcatgcagttcttttcttttgctagaa1059aagttatgttaaattttgtttaacttgaca1119gtaaacaaatactggaaaagcaaagcttat1179tgttcatcttttgctgagggaggaatagct1239ttcttttttggaattttatttttacctctt1299tgctctcttttttgtttaca1359gttgataatttcatttaggaaacattgtct1419aaaatactgaagtgcctcttttttattagg1479cctattgtgattggtgttagatctgtaaga1539gaccggtttgagagcatctctcgcgttctt1599gatcctgcacagtatcaggtgccagttatg1659gtcctgcagatatctcttagataaaagtgg1719gtttaaaagtQ-Q-Q-OX Q-Q-Q-Q-Cctccagttac1779ttcctgagttgctcggcatg1839ttccttccgtttgttcctgtggaataactg1899gttatcagtgtctgcatgttttttaataga1959gaaaaaacagcaattacttttgcatccatc2019tatacctatcaatcatccgtatctattcac2079acatccatctagccttctgtcaatcatcta2139ttatcaagtcttgaaagggggacatgtttc2199tattagaaccttgaaatggtgaagttgtgg2259agttcataatttttagtataacagctaagt2319gtcgtaactgtccttttccctagagaagtg2379tcatgacttctgcaaatactttccagcgga2439ggtcttgctgcgcaggaatgtaaacactgt2499gagatggggacgcttcccatgttgtgggga2559tgcctctgttggaacgccaagtgcctgcaa2619gttggcaaaatagttctttatgctatttct2679tggaatatgcactgtaaatcaaatttttct2739tttcttctgtgcctgattaaattaactgtg2799ttgggagaaaaattatcttttcttgaaaga2859agttaatgggagaatgtggttttgattctg2919cttgtgtgaagagagttgtcctgtgctcct2979aaagtgatgtgcttcagagaagggttcctc3039ttaatgttgaggttttttaa3.3.3. 3.3.3.3.3. 3099gcatgattattggcatctgcttacgatggc3159ctatttagcctcattttagaatgcagtcaa32193273
<211>183
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>权利要求
1.一种核因子TDRP1，其特征在于，该核因子的氨基酸序列如SEQ ID N02所示。
2.如权利要求1所述的核因子，其特征在于，该核因子的核苷酸序列如SEQID NO 1所7J\ ο
3.权利要求1所述的核因子的制备方法，其特征在于，按照SEQID NO 2的氨基酸序列人工合成。
4.含有权利要1所述核因子的核苷酸编码序列的克隆载体或者表达载体。
5.权利要求1所述的核因子的多克隆抗体。
6.权利要求5所述多克隆抗体的制备方法，其特征在于，该方法包括下述步骤(1)获得全长编码序列基因；(2)将基因与原核表达载体重组；(3)将重组表达载体转导原核表达系统；(4)用IPTG诱导TDRPl的表达，表达后的TDRPl经谷胱甘肽亲和层析加以纯化，并用凝 血酶从融合蛋白中切除GST标签获得纯化好的TDRPl蛋白；(5)纯化后的TDRPl免疫新西兰白兔，获得TDRPl多克隆抗体血清。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的原核表达载体是PGEX-4T-2。
8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的原核表达系统是R0SSET(DE3)或 BL21(DE3)。
9.权利要求1所述核因子的应用，其特征在于，将该核因子用于调控精子发生或睾丸 发育过程。
全文摘要
本发明属生物技术领域，具体涉及新型核因子TDRP1的表达、多克隆抗体制备以及应用。该核因子TDRP1的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示，核苷酸编码序列如SEQ ID NO 1所示。本发明还提供了TDRP1的多克隆抗体。该多克隆抗体特异性好，效价较高。TDRP1主要表达于精母细胞，能够表达在细胞核。对不同发育年龄大鼠的研究发现，Tdrp1基因和蛋白在新生的大鼠睾丸组织表达量极低，随着大鼠性发育的成熟，TDRP1在细胞核中的表达越来越多。研究结果显示TDRP1是一个在精子发生或睾丸发育过程中发挥重要作用的核因子。
文档编号C12N15/63GK102127163SQ20101002304
公开日2011年7月20日 申请日期2010年1月20日 优先权日2010年1月20日
发明者丁强, 姜昊文, 王宣春 申请人:复旦大学附属华山医院