突变型因子viii组合物和方法
【技术领域】
[0001] 本申请要求享有于2013年6月24日提交的顺序号为61/838867的美国临时专利 申请的优先权。上述申请的全部内容在此通过引用的方式并入本文。
[0002] 本发明涉及相比相应的野生型人因子VIII显示出更高的表达水平的重组人因子 VIII突变体。本发明还涉及制备和使用重组人因子VIII突变体的方法。
[0003] 政府许可权
[0004] 本发明是在美国国立卫生研究院授予的授权号HL084381的美国政府支持下作出 的。美国政府因此对本发明具有一定许可权利。
【背景技术】
[0005] 血友病A，是最常见的严重的遗传性出血性疾病，由血浆蛋白因子VIII的缺乏或 缺陷引起。在患有血友病A的患者中，当血友病患者受伤时，血液不正常凝结导致出血过 多。治疗方法由使用（纯化的）血浆或重组蛋白制品的替代疗法组成。
[0006] 当血小板附着到受伤血管的切口壁时，在受损部位凝血开始。随后，在酶调节的反 应的级联中，可溶性纤维蛋白原分子通过酶凝血酶被转变为使血小板聚集在血栓中的纤维 蛋白的不溶性丝。在级联中的每一步，蛋白前体被转变为在系列中切割下一个前体蛋白的 蛋白酶。在大多数步骤中需要辅因子。
[0007] 因子VIII作为非活性的非共价的金属离子依赖性异源二聚体前体在血液中循 环，紧密和非共价地结合von Willebrand因子。蛋白质的这种procofactor形式包含由 Al(al)A2(a2)B结构域组成的重链（HC)和由（a3)A3ClC2结构域组成的轻链（IX)，小写字 体a代表酸性残基中富含的短（~30-40个残基）片段。因子VIII是在由凝血酶或因 子Xa催化的A1A2、A2B和A3A3结点通过溶蛋白性裂解而蛋白水解活化的，这用来使其与 von Willebrand因子分离并在级联中活化其促凝血功能。在其活性形式，所述蛋白质因子 Villa是在酶原因子X向丝氨酸蛋白酶（因子Xa)的膜依赖性转变中将丝氨酸蛋白酶因子 IXa的催化效率以几个数量级增加的辅因子。
[0008] 基因疗法已经被提出作为治疗方式用于补充在血友病患者中的凝血因子缺乏， 并且已经尝试设计适合于治疗人类的FVIII构建体。例如，Connelly等人报道用编码人 FVIII的腺病毒载体治疗FVIII缺乏小鼠导致生物活性的人FVIII的表达（Connelly等人， Blood，第91卷，第9期（1998)，第3273-3281页）。Sarkar等人报道在小鼠模型中与FVIII 组合使用AAV8血清型修正血浆FVIII活性（Sarkar等人，Blood，第103卷，第4期（2004)， 第 1253 至 1260 页）。
[0009] 然而，如在基因疗法的许多方面中，理论要比成功有效的实施简单得多。实施基因 疗法技术的困难包括在使用病毒作为基因载体和FVIII的表达水平不足所遇到的问题。例 如，人FVIII分泌非常低效且产率相比相似的蛋白质（如因子V)以对数形式降低。此外， 虽然病毒作为基因载体是有效的，因为它们可以用于转导细胞导致体内蛋白质表达，但是 包被病毒颗粒的蛋白质可以激活机体的免疫系统。
[0010] 因此，鉴于上述情况，需要可以有效地表达足够量的靶FVIII蛋白以将病毒载体 的所需剂量减少到可接受的水平。
【发明内容】
[0011] 概要
[0012] 本发明提供修饰的因子VIII(FVIII)蛋白、编码FVIII的核酸和FVIII表达载体， 以及在FVIII缺乏（如血友病A)的治疗中使用所述修饰的FVIII基因的方法。
[0013] 在一个方面，本发明提供了一种相比野生型因子VIII具有增加的表达或分泌的 突变型人因子VIII。
[0014] 在一个实施方式中，所述重组突变型人因子VIII包括选自I86、Y105、A108、D115、 Q117、F129、G132、H134、M147、L152和其组合中的一个或多个氨基酸取代。
[0015] 在另一个实施方式中，所述重组突变型人因子VIII包括选自I86V、Y105F、A108S、 D115E、Q117H、F129L、G132K、H134Q、M147T、L152P和其组合中的一个或多个氨基酸取代。
[0016] 在另一个实施方式中，所述重组突变型人因子VIII包括186、Y105、A108、D115、 Q117、F129、G132、H134、M147和L152各氨基酸的氨基酸取代。
[0017] 在另一个实施方式中，所述重组突变型人因子VIII包括I86V、Y105F、A108S、 D115E、Q117H、F129L、G132K、H134Q、M147T 和 L152P 氨基酸取代。
[0018] 在另一个实施方式中，所述重组突变型人因子VIII包括选自186、A108、G132、 M147、L152和其组合中的一个或多个氨基酸取代。
[0019] 在另一个实施方式中，所述重组突变型人因子VIII包括选自I86V、A108S、G132K、 M147T、L152P和其组合中的一个或多个氨基酸取代。
[0020] 在另一个实施方式中，所述重组突变型人因子VIII包括I86V、A108S、G132K、 M147T和L152P各自的氨基酸取代。
[0021] 在另一个实施方式中，所述重组突变型人因子VIII包括氨基酸取代I86V、A108S、 G132K、M147T 和 L152P。
[0022] 在其他实施方式中，所述人因子VIII突变体还包括在人因子VIII的B结构域中 的缺失。
[0023] 在其他实施方式中，所述人因子VIII突变体还包括人因子VIII的a2和/或a3 结构域。
[0024] 在另一个方面，本发明提供了分离的多核苷酸序列，其编码本文描述的人因子 VIII突变体。
[0025] 在又一个方面，本发明提供了可操作地连接编码本文描述的人因子VIII突变体 的多核苷酸的表达载体。
[0026] 在进一步的方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含可操作地连接编码本文 描述的人因子VIII突变体的多核苷酸的表达载体。
[0027] 在另一个方面，本发明提供了一种用于治疗患有因子VIII缺乏的患者的方法，其 包括向有此需要的患者施用对治疗所述因子VIII缺乏有效量的含有可操作地连接编码本 文描述的人因子VIII突变体的多核苷酸的表达载体的药物组合物。
[0028] 在另一个方面，本发明提供了一种表达人因子VIII多肽突变体的方法，其包括： (a)用可操作地连接编码根据本发明的人因子VIII突变体的多核苷酸的表达载体转化宿 主细胞；(b)在适合表达人因子VIII多肽突变体的条件下使宿主细胞生长；和（c)从表达 所述突变体的宿主细胞中纯化人因子VIII多肽突变体。
【附图说明】
[0029] 图1示出了人因子VIII重和轻链的结构域，包括本发明中所用的几个重链结构。
[0030] 图2是显示与具有10个示例性的取代以增强分泌的经修饰的因子VIII并排的分 泌的人因子VIII重链的前200个氨基酸的排列的图。
[0031] 图3是显示与具有5个示例性的取代以增强分泌的经修饰的人因子VIII并排的 分泌的人因子VIII重链的前200个氨基酸的排列的图。
[0032] 图4总结了确定为影响人因子VIII分泌的示例性氨基酸。
[0033] 图5和图6描绘了示例性的用于表达B结构域缺失的人因子VIII突变体或人因 子VIII重链的AAV载体。
[0034] 图7显示了在BHK细胞（图A)或293细胞（图B)中不同的人因子VIII突变体 的分泌的比较。
[0035] 图8显示了在体内就分泌而言不同的人因子VIII突变体的分泌的比较。将质粒 pAAV-CB-hBDDF8 (携带B结构域缺失的人因子VIII)、质粒pAAV-CB-hBDDF8-X10 (携带具有 10个取代的hF8-BDD)、质粒pAAV-CB-hBDD-F8-X5 (携带具有5个取代的hBDDF8)或质粒 pAAV-CB-hBDD-F8-G312K(具有G132K取代的hF8)注射于因子VIII双基因敲除Blab/c小 ￡3 邱U
[0036] 图9显示了在293细胞中不同的人因子VIII突变体分泌的比较。hBDD-F8-X10 中的氨基酸被恢复到其相应的野生型氨基酸。在hBDD-F8-X10-6p中，不同于野生型F8的 hBDD-F8-X10中的10个氨基酸中的6个被恢复到它们的野生型氨基酸。
[0037] 图10显示了在AAV载体构建体中的突变体因子VIII(F8)重链（HC1690-X10)与 野生型hF8-HC1690AAV载体构建体（AAV/hF8HC1690)在体内的表达和分泌的比较。
[0038] 图11显示了在293细胞中不同的G132因子VIII重链突变体的分泌的比较。
[0039] 图12显示了在因子VIII双基因敲除Blab/c小鼠中就表达/分泌而言不同的因 子VIII的重链突变体的分泌的比较。
[0040] 图13显示了在293细胞中不同的L152因子VIII重链突变体的分泌的比较。
[0041] 图14显示了在293细胞中不同的A108因子VIII重链突变体的分泌的比较。
[0042] 图15显示了在293细胞中不同的M147因子VIII重链突变体的分泌的比较。
[0043] 图16显示了在F8-/-大鼠模型中没有形成针对5个突变氨基酸的中和抗体。
【具体实施方式】
[0044] 详细说明
[0045] 有关本发明的生物分子的各种术语的定义同上，也可用于整个说明书和权利要求 书。
[0046] 短语"分泌增强因子VIII (seFVIII，seF8) "是指一种修饰的FVIII (F8)，其已被遗 传改变使得所编码的蛋白质在与未经修饰的FVIII相比时表现出至少10%或20%或50% 或100%的在分泌方面的增长。本文描述的核苷酸序列可容易地从GenBank中获得。对于 人FVIII，请见登录号NG-011403. 1。
[0047] 短语"BDD"指的是缺少B结构域的"无 B结构域"因子VIII (F8或FVIII)突变体。
[0048] 短语"一个或多个"，后跟要素或种类的列表，旨在包含列表中的要素或种类的任 何排列。因此，例如，短语"选自A、B、C、D、E和F中的一个或多个取代突变"可以包括含有 A、B、C、D、E和/或F的取代突变的任何组合。
[0049] 如本文所用，范围可以表示为从一个特定整数值至另一个特定整数值。在表达这 样的范围时，应当理解的是，在此范围内的任一和全部整数值定义了根据本发明的单独的 实施方式，并且实施方式的全部范围包括在所述范围内进一步包括在最初范围中的整数值 的任何配对之间的任一和全部子范围。
[0050] 关于本发明的核酸，术语"分离的核酸"，在应用于DNA时，指的是一种DNA分子， 所述DNA分子与其从中起源的生物体的天然存在的基因组中的与它紧邻的（在5'和3'方 向）序列分离。例如，"分离的核酸"可以包括插入到载体（如质粒或病毒载体）中的DNA 或cDNA分子，或整合到原核生物或真核生物的DNA。核酸密码子可被最优化以增强在哺乳 动物细胞中的表达。
[0051 ] 对于本发明的RNA分子，术语"分离的核酸"主要是指由如上定义的分离的DNA分 子编码的RNA分子。或者，该术语可以指的是一种RNA分子，所述RNA分子已充分地与在天 然状态下（即，在细胞或组织中）将会与它相关的RNA分子分离，使得它以"基本上纯的"的 形式存在（术语"基本上纯的"在下面定义）。
[0052] 对于蛋白质，术语"分离的蛋白质"或"分离和纯化的蛋白质"有时也用于本发明。 此术语主要是指由本发明的分离的核酸分子的表达产生的蛋白质。或者，该术语可指已充 分地与会与它天然相关的其它蛋白质分离以便以"基本上纯的"形式存在的蛋白质。
[0053] 术语"启动子区域"是指基因的转录调节区，其可在编码区的5'或3'侧、或在编 码区内、或内含子中找到。
[0054] 术语"载体"是指一种小载体DNA分子，DNA序列可被插入其中以引入到宿主细胞 中，在宿主细胞中其将被复制。"表达载体"是包含具有在宿主细胞中表达所需要的必要调 节区的基因或核酸序列的专用载体。
[0055] 术语"可操作地连接"是指编码序列表达所必需的调节序列置于相对于所述编码 序列的适当位置上的DNA分子中，以便实现编码序列的表达。此相同的定义有时应用于表 达载体中的编码序列和转录控制元件（例如，启动子、增强子和终止元件）的排列。此定义 有时也应用于第一和第二核酸分子的核酸序列的排列，其中产生杂种核酸分子。
[0056] 术语"基本上纯的"是指包含至少50-60重量％的目的化合物（例如，核酸、寡核 苷酸、蛋白质等）的制品。更优选地，所述制品包含至少75重量％且最优选90-99重量％ 的目的化合物。纯度通过适合于所述目的化合物的方法（例如，色谱法、琼脂糖或聚丙烯酰 胺凝胶电泳、HPLC分析等）测定。
[0057] "基本上由…组成"一词，在指特定核苷酸序列或氨基酸序列时，指的是具有给定 序列号（SEQ ID N0)的属性的序列。例如，在用于参照氨基酸序列时，该词包括序列本身和 将不会影响序列的基本和新颖特征的分子修饰。
[0058] 本文所用术语"寡核苷酸"是指本发明的引物和探针，并且被定义为由两个或多个 核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸（优选超过三个）组成的核酸分子。寡核苷酸的准确尺寸 将取决于各种因素，并且取决于使用寡核苷酸的特定应用。如本文所用的术语"探针"是指 寡核苷酸、多核苷酸或核酸，无论是RNA或DNA，无论是如在纯化的限制性酶消化中自然存 在的或是合成产生的，所述探针能够与具有与所述探针互补的序列的核酸退火或特异性杂 交。探针可以是单链的或双链的。探针的确切长度将取决于许多因素，包括温度、探针的来 源和使用方法。例如，对于诊断应用，根据靶序列的复杂性，寡核苷酸探针通常含有15-25 个或更多个核苷酸，尽管它可含有更少的核苷酸。
[0059] 本文所用术语"百分比相同"参考核酸或氨基酸序列之间的比较。核酸和