105、A108、D115、Q117、F129、G132、H134、M147 和 / 或 L152 处的一个或多个取代进一步修 饰的已增加了在培养基中的分泌的因子VIII的核苷酸序列。
[0120] 在进一步的实施方式中，所述分离的核酸分子可以具有编码连同在位置186、 Y105、A108、D115、Q117、F129、G132、H134、M147 和 / 或 L152 处的一个或多个取代一起的具 有一个或多个非天然发生的糖基化位点的因子VIII的核苷酸序列。
[0121] 在又一个实施方式中，所述分离的核酸分子编码用在位置186、Y105、A108、D115、 Q117、F129、G132、H134、M147和/或L152处的一个或多个取代修饰并且进一步修饰成具有 下列修饰中的任何组合的重组因子VIII :修饰成无 B结构域的、修饰成嵌合的、修饰成具有 融合的A2-A3结构域、修饰成具有一个或多个改变的失活裂解位点的、修饰成具有增强的 因子IXa和/或因子X的亲合力的、修饰成具有提高的分泌的、修饰成具有增加的循环半衰 期的以及修饰成具有一个或多个非天然发生的糖基化位点的。
[0122] 本发明的另一个方面涉及一种用于表达本文描述的突变型因子VIII多核苷酸的 表达载体。如本文所用，术语"表达载体"是指一种病毒或非病毒载体，其以适合于在宿主 细胞中表达多核苷酸的形式包含编码本发明的新肽的多核苷酸。一种类型的非病毒的载体 是"质粒"，质粒包括可以连接另外的DNA片段到其中的环状双链DNA环。另外，在本说明书 中，"质粒"和"载体"可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。
[0123] 当制备表达载体时，可以将转基因序列插入到含有用于在细菌以及真核细胞中复 制的合适细菌序列的质粒。可以使用任何方便的质粒，所述质粒可以包括允许在细菌中选 择的标记以及通常一个或多个独特的、便利的定位的限制性位点。载体的选择将取决于优 选的转化技术和转化用的靶宿主。
[0124] 用于表达突变型因子VIII多肽的表达载体包括一个或多个可操作地连接到待表 达的多核苷酸序列的调节序列。本领域的技术人员将理解，表达载体的设计可取决于如待 转化的宿主细胞的选择、所需的蛋白质的表达水平等的这样的因素。本发明的表达载体可 以被引入宿主细胞，从而制得本文描述的突变型因子VIII蛋白。
[0125] 如本文所使用的，术语"控制序列"或"调节序列"指可操作连接的编码序列在特 定宿主生物体中的表达所必需的DNA序列。术语"控制/调节序列"旨在包括启动子、增强 子和其他表达控制元件（例如，多腺苷酸化信号）。控制/调节序列包括在许多类型的宿主 细胞中指导核苷酸序列的组成型表达的那些和仅在某些宿主细胞中指导核苷酸序列的表 达的那些（例如，组织特异性调节序列）。
[0126] 当将一个核酸序列置于与另一个核酸序列的功能关系中时，所述一个核酸序列 "可操作地连接"到所述另一个核酸序列。例如，将前序列或分泌前导肽的DNA可操作地连 接到多肽的DNA，如果它表达为参与该多肽的分泌的前蛋白；将启动子或增强子可操作地 连接到编码序列，如果它影响序列的转录；或者将核糖体结合位点可操作地连接到编码序 列，如果它被定位以便促进翻译。通常，"可操作连接"意味着被连接的DNA序列是邻接的， 并且在分泌前导的情况下是邻接的且处于阅读状态。然而，增强子不必是邻接的。连接是 通过在方便的限制性位点连接来完成。如果此类位点不存在，依照常规实践使用合成的寡 核苷酸接头或连接体。
[0127] 用于指导在哺乳动物细胞中表达的合适的表达载体通常包括启动子，以及本领域 中已知的其它转录和翻译控制序列。在某些实施方式中，哺乳动物表达载体能够指导多核 苷酸优先在特定细胞类型中表达（例如，组织特异性调节元件用于表达多核苷酸）。组织特 异性调节元件是本领域已知的并且可以包括，例如，肝细胞特异性启动子和/或增强子（例 如，白蛋白启动子、α-l抗胰蛋白酶启动子、载脂蛋白E增强子）。或者，可以使用在几乎任 何细胞类型中都有活性的组成型启动子（例如，人巨细胞病毒）。
[0128] 在某些优选的实施方式中，表达载体是病毒载体。病毒载体的一个或多个病毒基 因通常已被移除，并且病毒载体包括插入到用于插入外源转基因（包括本文描述的突变型 因子VIII)的病毒基因组插入位点的基因/启动子盒。被移除的基因的必要的功能可以由 已被工程化以表达的转基因中早期基因的基因产物的细胞系提供。示例性的病毒载体包 括，但不限于，腺相关病毒（AAV)载体，逆转录病毒载体，包括慢病毒载体、腺病毒载体、疱 疹病毒载体和甲病毒载体。其他病毒载体包括星状病毒、冠状病毒、正粘病毒、乳多空病毒、 副粘病毒、细小病毒、微小核糖核酸病毒、痘病毒、披膜病毒载体等。病毒载体可包括任何合 适的核酸构建体，如DNA或RNA构建体，并且可以是单链、双链或双螺旋。
[0129] -旦在本发明的DNA构建体已被制备，它已准备好被引入到宿主细胞中。因此，本 发明的另一个方面涉及制备包含因子VIII核酸的重组细胞的方法。基本上，这需要通过转 化、转导、电穿孔、磷酸钙沉淀、脂质体等将DNA构建体引入到细胞，以及选择已引入的DNA 以游离型或整合到宿主基因组中的细胞。
[0130] 因此，本发明的另一个方面涉及包含编码本发明的重组因子VIII的分离的核酸 分子的宿主细胞。所述宿主细胞可以包含分离的核酸分子作为以游离质粒或稳定整合到 宿主细胞基因组中的形式的DNA分子。此外，宿主细胞可以构成用于产生重组突变型因 子VIII蛋白质的表达系统。合适的宿主细胞可以是，但不限于，动物细胞（例如，幼仓鼠 肾（"ΒΗΚ"）细胞）、中国仓鼠卵巢细胞（"CH0"）、细菌细胞（如大肠杆菌）、昆虫细胞 (例如，Sf9细胞）、真菌细胞、酵母细胞（例如，酵母属（Saccharomyces)或裂殖酵母属 (Schizosaccharomyces))、植物细胞（例如，拟南芥属或烟草细胞）、藻类细胞等。
[0131] 本发明的另一个方面涉及制备本发明的重组因子VIII的方法。此方法包括使本 发明的宿主细胞在由此所述宿主细胞表达重组因子VIII的条件下生长。然后，将所述重组 因子VIII分离。在一个实施方式中，宿主细胞在生长培养基中于体外生长。在一个具体的 实施方式中，合适的生长培养基可以包括，但不限于，含有von Willebrand因子的（本文中 称为"VWF"）的生长培养基。在这个实施方式中，宿主细胞可以包含编码VWF的转基因，或 者可以将VWF引入到生长培养基中作为补充。在生长培养基中的VWF将允许重组因子VIII 的更高表达水平。一旦重组因子VIII被分泌到生长培养基中，可以利用相关的重组DNA和 蛋白质领域中的普通技术人员公知的技术（包括本文所述的那些）将其从生长培养基中分 离。在另一个实施方式中，制备本发明的重组因子VIII的方法进一步包括在分离所述重组 因子VIII之前破坏宿主细胞。在此实施方式中，从细胞碎片中分离重组因子VIII。
[0132] 当重组产生时，所述因子VIII蛋白质或多肽（或其片段或突变体）在重组宿主细 胞（典型地，但不是排他地，真核生物）中表达。在某些优选的实施方式中，真核宿主细胞 (如哺乳动物细胞）用于产生如本文所述的突变型因子VIII多肽。适合用于实施本发明的 哺乳动物细胞包括，但不限于：C0S细胞（例如，ATCC No. CRL 1650或1651)，BHK细胞（例 如，ATCC No.CRL 6281)，CH0 细胞（ATCC No.CCL 61)，HeLa 细胞（如，ATCC No.CCL 2)，293 细胞（ATCC No. 1573)，CHOP 细胞和 NS-1 细胞。
[0133] 本发明的另一个方面涉及用于治疗患有因子VIII缺乏的患者的方法。在一个实 施方式中，这涉及向有此需要的患者施用对治疗所述因子VIII缺乏有效量的（如本文所述 的）重组突变型因子VIII。
[0134] 在一个具体的实施方式中，根据相同的用于注入人或动物因子VIII的程序，将重 组因子VIII单独地或者以药物组合物的形式（即，与稳定剂、递送赋形剂和/或载体组合） 静脉内注入患者体内。重组因子VIII的合适的有效量可以包括，但不限于，约10至约500 单位/千克患者体重。
[0135] 在另一个实施方式中，治疗患有因子VIII缺乏的患者的方法包括向有此需要 的的患者施用对治疗所述因子VIII缺乏有效量的包含编码突变型因子VIII或其功能 片段的表达载体的药物组合物。在某些实施方式中，重组因子VIII可以通过移植经遗 传改造以产生重组因子VIII的细胞（通常经由含有这样的细胞的装置的植入）来施 用。这种移植通常包括使用重组皮肤成纤维细胞的非病毒方法（Roth等人，New Engl. J. Med. 344:1735-1742(2001))。
[0136] 向因子VIII缺乏的患者施用编码FVIII的表达载体可导致FVIII多肽的足够的 表达以在功能上重建凝血连锁。表达载体可以单独使用或与在药学上可接受的或生物相容 的组合物中的其它治疗剂组合使用。
[0137] 所述编码FVIII的多核苷酸可以用作含有重链和轻链部分的单链分子（图10)或 在用于递送到患者的宿主细胞的病毒或非病毒载体中分成两个或多个分子（如，重链和轻 链；图11)。
[0138] 在本发明的一个优选实施方式中，包含编码突变型FVIII突变体的核酸序列的表 达载体是病毒载体。可在本发明中使用的病毒载体包括，但不限于，腺病毒载体（具有或不 具有组织特异性启动子/增强子），多种血清型的腺相关病毒（AAV)载体（例如AAV-1至 AAV-12等）和杂种AAV载体，慢病毒载体和伪类型慢病毒载体[例如，埃博拉病毒、水泡性 口炎病毒（VSV)和猫免疫缺陷病毒（FIV)]，单纯疱疹病毒载体，牛痘病毒载体，逆转录病毒 载体，慢病毒载体，非病毒载体等。
[0139] 在某些优选的实施方式中，提供了用于施用包含编码突变型FVIII或其功能片段 核酸序列的病毒载体的方法，其包括使用AAV载体或慢病毒载体。最优选地，分别仅包括载 体的主要部分（例如，ITR和LTR元件）。直接递送载体或离体转导人类细胞接着注入体内 将导致突变型FVIII的表达，从而通过增强促凝血活性发挥对止血的有益治疗效果。
[0140] 重组AAV载体和慢病毒载体已发现对各种基因治疗应用具有广泛的效用。其对这 些应用的效用主要是由于在各种器官背景下取得的体内基因转移的高效率。AAV和慢病毒 颗粒可有利地使用作为进行有效的基因递送的载体。这样的病毒粒子对于这样的应用具有 许多理想的特性，包括分裂和不分裂细胞的向性。用这些载体的早期临床经验还没有表现 出持续的毒性，并且免疫反应甚微或测不出。已知AAV通过受体介导的胞吞作用或通过胞 转而感染体内和体外的各种各样的细胞类型。这些载体系统已在靶向人类的视网膜上皮、 肝、骨骼肌、呼吸道、脑、关节和造血干细胞中进行了测试。它很可能是基于质粒DNA或小环 的非病毒载体也将是对于如编码FVIII的大基因合适的基因转移载体。
[0141] 所期望的是引入能够提供，例如，期望的基因的足够表达和最小的免疫原性 的载体。改良的AAV和慢病毒载体和生产这种载体的方法已经详细描述在许多参考 文献、专利和专利申请中，包括描述生产临床级载体的Wright J.F. (Hum Gene Ther 20:698-706, 2009)。慢病毒载体可以在CHOP生产，并且其他载体可以购自NHLBI基因治疗 资源计划（GTRP)-慢病毒载体生产核心实验室的慢病毒载体生产核心实验室。
[0142] 对于一些应用，表达构建体可以进一步包括用于驱动在特定细胞或组织类型中表 达的调节元件。这样的调节元件对本领域技术人员来说是公知的并且在Sambrook等人 (1989)和Ausubel等人（1992)中深度讨论。在本发明的表达构建体中引入组织特异性调 控元件提供了至少部分的用于表达突变型FVIII或其功能片段的组织嗜性。例如，编码在 巨细胞病毒（CMV)启动子控制下的突变型FVIII的核酸序列可用于骨骼肌表达或用于肝特 异性表达的hAAT-ApoE等。在慢病毒载体中的造血特异性启动子也可以有利地用于本发明 的方法。
[0143] 在一个优选的实施方式中，提供突变型FVIII序列作为在衣壳中包装的病毒载体 的组分。在一个特别优选的实施方式中，AAV载体用于在体内递送突变型FVIII (Gnatenko 等人，Br.J. Haematol. 104:27-36(1999))。在这种情况下，AAV载体包括至少一个突变型 FVIII和用于控制该突变型FVIII序列的表达的相关表达控制序列。如图10和图11所示， 示例性的用于表达突变型FVIII序列AAV载体可包括用于FVIII表达的启动子-增强子调 节区和起到确保促进复制以及将突变型FVIII核酸包装入AAV衣壳并将突变型FVIII核酸 整合到靶细胞基因组中的作用的顺式作用的ITR。优选地，所述AAV载体具有rep和cap基 因缺失，并由突变型hFVIII序列和与其相关的表达控制序列代替。如图10和图11所示， 所述突变型FVIII序列通常被插入与对病毒复制足够的一个或两个（即，侧翼的）AAV TR 或TR元件相邻。也可以包括其他的适合于促进突变型hFVIII序列在靶细胞中的组织特异 性表达的调节序列。
[0144] 包装的病毒载体的病毒衣壳组分可以是细小病毒衣壳。AAV Cap和嵌合衣壳是优 选的。合适的细小病毒病毒衣壳组分的实例是来自细小病毒家族（例如，自主性细小病毒 或依赖病毒）的衣壳组件。例如，病毒衣壳可以是AAV衣壳（例如，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、 AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV 9、AAV10、AAV11或AAV12衣壳；本领域技术人员将知道存在有 可能执行相同或相似功能的尚未确定的其它变体）或者可以包括来自两个或更多个AAV衣 壳的组分。AAVCap蛋白质的完整补体包括VP1、VP2和VP3。包含编码AAVVP衣壳蛋白的 核昔酸序列的0RF可包含小于完整补体AAV Cap蛋白，或者可以提供AAV Cap蛋白的完整 补体。
[0145] 如在Rabinowitz等人的第6491907号美国专利中所述，在一个或多个所述AAV Cap蛋白可以是嵌合蛋白，包括来自两个或更多个病毒（优选两个或更多个AAV)的氨基酸 序列AAV Cap。例如，嵌合病毒衣壳可以包括AAVICap蛋白或亚单位和至少一个A