氨基酸 序列的比较通常使用通过比对核酸或氨基酸的序列从而定义两者之间的差异的计算机程 序。核酸序列的比较可以购自威斯康星州麦迪逊的遗传学计算机组（Genetics Computer Group)的 GCG 威斯康星软件包版本 9. 1(GCG Wisconsin Package version 9· 1)进行。为 方便起见，由该程序规定的默认参数（空位产生罚分=12,空位延伸罚分=4)旨在用于本 发明以比较序列同一性。另外，可以使用有默认参数的空位排列的由国家生物技术信息中 心提供的Blastn 2. 0程序（在环球网ncbi. nlm. nih. gov/blast/上找到；Altschul等人， 1990, J Mol Biol 215:403-410)来确定核酸序列和氨基酸序列之间的同一性和相似性的 水平。
[0060] 如本文所用，"相应的"核酸或氨基酸或二者之一的序列是存在于因子VIII或杂种 因子VIII分子或其片段中的位点的，其与另一个物种的因子VIII分子中的位点具有相同 的结构和/或功能，尽管核酸或氨基酸标号可能不相同。"对应于"另一因子VIII序列的序 列基本对应于这样的序列，并且在严格条件下与SEQ ID NO: 1指定的人因子VIII DNA序列 杂交。"对应于"另一因子VIII序列的序列也包括导致因子VIII或权利要求保护的促凝血 杂交因子VIII或其片段的表达并将会与含有SEQ ID NO: 1的核酸分子杂交但为遗传密码 冗余的序列。
[0061] 如本文所用，"独特的"氨基酸残基或序列是指在一个物种的因子VIII分子中的氨 基酸序列或残基，其不同于另一个物种的因子VIII分子的同源残基或序列。
[0062] 如本文所用，"特异性活性"指的是将修正人因子VIII缺乏的血浆的凝血缺陷的 活性。特异性活性以在标准测定法（其中将人因子VIII缺乏的血浆的凝血时间与正常人 血浆的凝血时间相比较）中每毫克总因子VIII蛋白的凝血活性的单位来测量。一个单位 的因子VIII活性是在一毫升正常人血浆中存在的活性。在测定中，凝块形成的时间越短， 被测定的因子VIII的活性越大。在人因子VIII测定中杂种人/猪因子VIII具有凝血活 性。该活性，以及与其他杂种或杂种等效因子VIII分子或其片段的活性，可以小于、等于或 大于血浆衍生的或重组人因子VIII的活性。
[0063] 如本文所用，人类或动物因子VIII的"亚单位"是该蛋白质的重链和轻链。因子 VIII的重链含有三个结构域，A1、A2和B。因子VIII的轻链也包含三个结构域，A3、C1、C2。
[0064] 如本文所用，术语"表位"、"抗原基"和"抗原决定簇"同义使用，并且被定义为由 抗体特异性识别的人类、动物、杂种或杂种等效因子VIII或其片段的部分。它可以由任何 数目的氨基酸残基组成，并且它可以依赖于蛋白质的一级、二级或三级结构。根据本公开内 容，可以使用包括至少一个表位的杂种因子VIII、杂种因子VIII等效物、或二者任一片段 作为在下面所述的诊断测定法中的试剂。在一些实施方式中，与人或猪因子VIII相比，杂 种或杂种等效因子VIII或其片段与所有天然存在的抑制因子VIII的抗体没有交叉反应或 者少有交叉反应。
[0065] 如本文所用，术语"免疫原性位点"被定义为人或动物因子VIII、杂种或杂种等效 因子VIII、或其片段的区域，如通过常规方案（如免疫测定法，例如，如本文所述的，ELISA 或Bethesda测定法）所测定的，其特异性引发在人或动物中产生因子VIII、杂种、杂种等效 或其片段的抗体。它可以由任何数目的氨基酸残基组成，并且它可以依赖于蛋白质的一级、 二级或三级结构。在一些实施方式中，与人或猪因子VIII相比，杂种或杂种等效因子VIII 或其片段在动物或人类中没有免疫原性或免疫原性更低。
[0066] 如本文所用，"因子VIII缺乏"包括由缺陷型因子VIII的产生、由因子VIII生产 不足或不产生、或由因子VIII被抑制剂部分或完全抑制而引起的凝血活性的缺乏。血友病 A是由X连锁基因的缺陷以及其编码的因子VIII蛋白的缺失或缺乏引起的因子VIII缺乏 的一种类型。
[0067] 在一个方面，本发明涉及重组因子VIII突变体分子（如蛋白质或核酸），其特征在 于，相比野生型因子VIII增加的表达和/或分泌。
[0068] 示例性的人因子VIII的cDNA(核苷酸）和预测的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2。人因子VIII是被合成且分泌为约300kDa的具有内部序列同源性的 2332个氨基酸的单链蛋白质，其定义了一系列的结构"域"如下：NH2-Al-al-A2-a2-B-a3-A 3-C1-C2-C00H(图4)。如本文所使用，因子VIII"结构域"由特征在于例如结构相关的结构 域的内部氨基酸序列同一性和凝血酶的溶蛋白性裂解位点的氨基酸的连续序列所定义。此 外，术语"无结构域的"或"缺乏结构域的"应被理解为是指该结构域的至少95%或100% 已被缺失。除非另有规定，因子VIII结构域由以下的在如SEQ ID Ν0:2所述的人因子VIII 的氨基酸序列中的氨基酸残基所定义：
[0069] A1，残基 Alal_Arg372
[0070] A2，残基 Ser373-Arg740
[0071] B，残基 Ser741_Argl648 ;
[0072] a3,残基 P1640_Argl649 ;
[0073] A3,残基 Serl690_Ile2032 ;
[0074] C1，残基 Arg2033-Asn2172 ;和
[0075] C2,残基 Ser2173_Tyr2332
[0076] A3-C1-C2 序列包括残基 Serl690-Tyr2332。剩余序列，残基 Glul649-Argl689,通 常称为因子VIII轻链激活肽（图1)。因子VIII是由凝血酶或因子Xa蛋白水解活化的， 其使因子VIII与从von Willebrand因子分离，形成因子Villa，其具有促凝血功能。因子 Villa的生物学功能是将因子IXa向因子X活化的催化效率以几个数量级增加。凝血酶激 活的因子Villa是160kDa的A1/A2/A3-C1-C2异源三聚体，其在的血小板或单核细胞的表 面上与因子IXa和因子X形成复合物。
[0077] 编码野生型人因子VIII的cDNA序列具有如SEQ ID NO: 1所述的核苷酸序列。在 SEQ ID N0:1中，因子VIII开放读框的前57个核苷酸编码通常从SEQ ID N0:2所述的成熟 因子VIII蛋白切除的信号肽序列。
[0078] 优选的重组因子VIII突变体包括或编码SEQ ID N0:2所述的野生型人因子VIII 氨基酸序列的氨基酸86至氨基酸152的区域中的一个或多个氨基酸取代。这些位置中的 任意位置的取代可以采用其他19个氨基酸中任何一个。
[0079] 参照在此描述的突变体，由"（氨基酸a) - (SEQ ID N0:2氨基酸#b)-(氨基酸c) " 表示的概念应被理解为在SEQ ID N0:2的氨基酸标号b的野生型氨基酸a(单字母代码） 已突变为氨基酸c〇
[0080] 在某些优选的实施方式中，人因子VIII多肽突变体包括选自186、Y105、A108、 D115、Q117、F129、G132、H134、M147和L152中的SEQIDN0:2中的一个或多个氨基酸取代。 此外，人因子VIII突变体包括含有这十个氨基酸位点的突变的任意排列。图4中显示了示 例性的人因子VIII突变体。
[0081] 本发明的示例性重组因子VIII包括涉及在SEQ ID N0:2的186位置处的取代的 点突变。优选的取代包括缬氨酸（即，I86V)。进一步优选的取代包括亮氨酸（I86L)和蛋 氨酸（I86M)。
[0082] 另一个示例性重组因子VIII包括涉及在SEQ ID N0:2的Y105位置处的取代的点 突变。所述取代可以包括其他19个氨基酸中的任何一个。优选的取代包括Y105F和Y105W。
[0083] 另一个示例性重组因子VIII包括涉及在SEQ ID N0:2的A108位置处的取代的点 突变。优选的取代包括：A108S。进一步优选的取代包括A108S、A108G、A108I^PA108P。
[0084] 另一个示例性重组因子VIII包括涉及在SEQ ID N0:2的D115位置处的取代的 点突变。优选的取代包括：D115E。进一步优选的取代包括D115N、D115H、D115Q、D115R和 D115K〇
[0085] 另一个示例性重组因子VIII包括涉及在SEQ ID N0:2的Q117位置处的取代的 点突变。优选的取代包括：Q117H。进一步优选的取代包括Q117N、Q117E、Q117D、Q117R和 Q117K〇
[0086] 另一个示例性重组因子VIII包括涉及在SEQ ID NO: 2的F129位置处的取代的点 突变。优选的取代包括：F129L。进一步优选的取代包括F129V、F129I、F129M、F129P、F129T 和 F129K。
[0087] 另一个示例性重组因子VIII包括涉及在SEQ ID N0:2的G132位置处的取代的点 突变。优选的取代包括：G132K。进一步优选的取代包括G132E、G132D、G132R、G132T、G132M、 G132N、G132S 和 G132W。
[0088] 另一个示例性重组因子VIII包括涉及在SEQ ID NO: 2的H134位置处的取代的点 突变。优选的取代包括：H134Q。进一步优选的取代包括H134G、H134Y、H134N、H134E、H134D、 H134R 和 H134K。
[0089] 另一个示例性重组因子VIII包括涉及在SEQ ID N0:2的M147位置处的取代的点 突变。优选的取代包括：M147T。进一步优选的取代包括M147A、M147G、M147S和M147P。
[0090] 另一个示例性重组因子VIII包括涉及在SEQ ID N0:2的L152位置处的取代的点 突变。优选的取代包括：L152P。进一步优选的取代包括L152S、L152G和L152T。
[0091] 另一个示例性重组因子 VIII 包括在 SEQ ID N0:2 的 I86、A108、G132、M147、L152 位置处的一个或多个氨基酸残基的多个取代。所述取代可以包括含有这五个氨基酸位点的 突变的任意排列。【具体实施方式】可包括在选自I86V、A108S、G132K、M147T、L152P中的一个 或多个取代突变处的突变。进一步优选的实施方式包括2、3、4或5个取代，包括选自I86V、 A108S、G132K、M147T和L152P中的取代的任意组合（或排列）。
[0092] 示例性的重组因子VIII突变体包括涉及在选自186、Y105、A108、D115、Q117、 F129、G132、H134、M147和L152中的SEQ ID N0:2中的一个或多个氨基酸残基处的取代的 点突变。所述取代可以包括含有这十个氨基酸位点的突变的任意排列。【具体实施方式】可包 括在选自 I86V、Y105F、A108S、D115E、Q117H、F129L、G132K、H134Q、M147T 和 L152P 中的一 个或多个取代突变处的突变。进一步优选的实施方式包括2、3、4或高至9个取代，包括选 自 I86V、Y105F、A108S、D115E、Q117H、F129L、G132K、H134Q、M147T 和 L152P 中的取代的任 意组合（或排列）。
[0093] 编码上述提及的因子VIII取代的核酸被包括在本发明中并且包括编码本文中所 描述的取代突变体的广度的所有可能的核酸。
[0094] 相比于野生型因子VIII的生产（在细胞系或在体内），上述的因子VIII突变体 可以表现出因子VIII分泌的5%至10000倍、10%至2000倍、50%最高至500倍、2至200 倍、5至100倍、10至50倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少 100倍、至少200倍、至少500倍、至少2000倍或至少10000倍的增加。
[0095] 在某些实施方式中，合适的突变型因子VIII序列可被进一步修饰以包括、缺失或 修饰其他因子VIII序列以赋予关于其他属性的性质，包括，但不限于，抗原性、循环半衰 期、蛋白分泌、对因子IXa和/或因子X的亲合力、改变的因子VIII失活裂解位点、激活的 因子VIII的形式的稳定性、免疫原性和保存期限。
[0096] 在某些【具体实施方式】中，所述突变型因子VIII可以被修饰以产生B结构域缺失 (BDD)的或"无 B结构域"的因子VIII产品。图1显示了示例性的含有SEQ ID N0:2的氨 基酸残基1-740和1690-2332的BDD因子VIII实施方式。优选地，所述重组无 B结构域的 因子 VIII 包含如本文所述的在位置 186、Y105、A108、D115、Q117、F129、G132、H134、M147、 L152处的一个或多个取代。
[0097] 在一个实施方式中，所述无 B结构域的重组因子VIII被生成，由此B结构域被替 换为DNA接头部分并且至少一个密码子被替换为编码与猪因子VIII的相应残基具有相同 的电荷的氨基酸残基的密码子（参见，例如，Hauser等人的第2004/0197875号美国专利申 请公开）。
[0098] 在另一个实施方式中，所述无 B结构域的重组因子VIII被生成在一个或多个位置 中插入有截短的因子IX内含子1(参见，例如，Negrier的第6800461号美国专利和Negrier 的第6780614号美国专利）。此重组因子VIII可用于在体外获得较高的重组因子VIII的 产生以及用于基因治疗的转移载体（参见，例如，Negrier的第6800461号美国专利）。在 一个具体的实施方式中，所述重组因子VIII可以由在两个位置中插入有截短的因子IX内 含子1并且具有适合于在造血细胞系中（特别在血小板中）驱动表达的启动子的核苷酸序 列来编码（参见，例如，Negrier的第6780614号美国专利）。
[0099] 可以根据本发明修饰的合适的突变型因子VIII的第二个例子是含有一种或多种 动物氨基酸残基作为对引起人