具有降低的免疫原性的因子viii突变蛋白的制作方法

专利名称：具有降低的免疫原性的因子viii突变蛋白的制作方法
技术领域：
一般而言，本发明涉及突变因子VIII分子(因子VIII突变蛋白)，其在某些未加 帽的N-连接的糖基化位点中具有突变。这些突变蛋白质在治疗性使用时展现出降低的抗 原呈递树突细胞摄取和降低的免疫原性。
背景技术：
自天然来源分离的或经由重组方法合成的人治疗性蛋白质(生物制品)在对人 患者施用时可以诱导免疫应答。这些免疫应答可导致范围为轻度皮肤刺激(minor skin irritation)至治疗性药物的功效降低的效果，而且在一些情况中可以引起大面积器官衰 竭(massive organ failure) JI^Mt0用重组因子VIII (rFVIII)治疗的患者的约30%展现出免疫应答。这些患者中， 约三分之一展现出针对因子VIII (FVIII)的中和性抗体(nAb)，而且这些抗体可以干扰 FVIII 疗法的功效(Ehrenforth 等，Lancet 339 :594-598,1992 ；Gringeri 等，Blood 102 2358-2363,2003)。虽然FVIII的高剂量施用能降低nAb在此患者群体中的效果，与较高剂 量治疗方案有关的顺从性负担和成本是不想要的。主要类型的免疫引发性抗原呈递细胞(APC)是树突细胞(DC)。DC能经由不同类 型的细胞表面受体来胞吞蛋白质。胞吞导致将蛋白质加工成肽、将各种肽加载到MHC II类 (MHCII)蛋白上、和在细胞表面上展示肽MHCII复合物(Trombetta等，Annu Rev Immunol 23 =975-1028,2005)。T辅助细胞对这些肽的识别诱导下游事件，这可以导致免疫原性和/ 或免疫毒性。最近的报告提示了，⑶206(即一种甘露糖特异性受体)在APC摄取FVIII中起 作用。FVIII与⑶206间的相互作用导致对FVIII/⑶206复合物的胞吞和将rFVIII蛋白 降解成肽，然后所述肽由APC表面上的MHC II类蛋白展示(Dasgupta等，Proc Natl Acad Sci USA 104:8965-8970,2007)。已经显示了 CD206识别许多具有不同亲和力的不同碳水 化合物结构(甘露糖、岩藻糖、和N-乙酰葡糖胺)(Lee等，Science 295 1898-1901，2002)。 然而，在甘露糖受体家族的成员中，CD206表现为对甘露糖具有最大的亲和力。已经显示 了 FVIII含有加帽的(通过唾液酸化加帽的)和未加帽的(未唾液酸化的)糖基化位点 两者(Kaufman 等，J Biol Chem 263 :6352-6362,1988 ；Medzihradszky 等，AnalChem 69 3986-3994，1997)。未加帽的位点以甘露糖残基终止，因此有时称作甘露糖结尾的糖基化位 点。由于FVIII上未加帽的糖基化以甘露糖残基终止，它们可以起CD206的识别位点的作 用。用于加帽的或未加帽的糖基化的潜在位点存在于FVIII分子上在N-连接的糖基 化位点处。N-连接的糖基化存在于氨基酸序列基序N-X-S/T内的天冬酰胺残基上，其中X 可以是除脯氨酸以外的任何氨基酸。全长成熟的FVIII含有M个推定的N-连接的糖基化位点。人FVIII 含有结构域 A1-A2-B-A3-C1-C2 (Thompson，Semin Hematol29 11-22， 2003)。FVIII的B域是不必要的，因为B域缺失型FVIII (BDD)作为替代疗法用于血友病A 也是有效的。B域内有19个推定的N-连接的糖基化位点，因此完整的B域的除去留下BDD FVIII(BDD)中在氨基酸位置41、239、582、1810、和2118处的5个剩余的N-连接的糖基化 位点。氨基酸位置239、1810、和2118处的N-连接的糖基化位点通常显示比氨基酸位置41 和582处的位点高水平的N-连接的糖基化。具有改变的糖基化样式的重组蛋白的生产呈现了数项挑战，包括来自重组培养的 生产性产量的潜在下降和/或重组蛋白的活性降低。本领域中已经认可了 FVIII免疫原性的问题，而且已经提示了用于降低FVIII免 疫原性的许多办法，目标为改善其治疗功效。可以通过将FVIII与醇性聚合体诸如聚乙二醇偶联(PEG化)来降低FVIII的免 疫原性(美国专利号4，970，300)。美国专利号7，351，688披露了复合治疗性蛋白质诸如 FVIII与结合剂诸如磷脂。人/动物FVIII杂合分子(其中已经用猪FVIII序列替换人 FVIII分子的某些免疫原性部分)描述为在人中比人FVIII具有更小的免疫原性(参见例 如美国专利号5，364，771 ；6, 180，371 ；6, 458, 563 ；及7，012，132)。可以通过将额外的N-连 接的糖基化位点弓丨入已知与抗FVI11抗体起反应的FVI11表位中来降低FVI11的免疫原性 (美国专利号6，759,216)。已经提出的另一种策略是通过将突变引入FVIII分子中与抗FVIII抗体结合的区 域中来降低FVIII的免疫原性(参见例如美国专利号7，211，559 ；7, 122，634 ；7, 033，791 ； 6，770，744 ；及 6，376，463)。含有在FVIII分子中的数个氨基酸位置(包括第239位、第1810位、第1812位、 和第2118位)处引入半胱氨酸残基的突变的FVIII突变蛋白，其中所引入的半胱氨酸残基 为FVIII突变蛋白的PEG化提供位点(美国公开的专利申请号20060115876A1)。如此，治疗性蛋白质诸如展现出抗原呈递树突细胞摄取降低和免疫原性降低的 FVIII会为需要FVIII疗法的患者(例如血友病)提供一种有用的治疗。发明概述本发明提供了一种重组FVIII分子，其包含一个或多个天然存在的未加帽的、 N-连接的糖基化序列基序内发生于FVIII分子的氨基酸位置41-43、239-对1、582-584、 1810-1812、和2118-2120处的突变。在一个实施方案中，突变在氨基酸位置41、239、1810、 1812、或2118处不引入半胱氨酸残基。这些突变阻止已经突变的位点在有糖基化能力的 宿主细胞中表达rFVIII分子时被糖基化。在一个实施方案中，突变发生于氨基酸位置 239-241、1810-1812、和 2118-2120 之一处或多处(one or more)。在另一个实施方案中，所述FVIII分子是B域缺失型FVIII突变蛋白(BDD突变蛋 白)。已经发现了在未加帽的N-连接的糖基化位点中具有取代的BDD突变蛋白以相对较高 的水平重组表达，而且它们展现出与非突变BDD相似的或与非突变BDD相比升高的活性水 平。在别的实施方案中，本发明包含一种编码rFVIII分子的分离的核酸。
在另一个实施方案中，本发明包含编码本发明核酸的表达载体。在另一个实施方案中，本发明包含有糖基化能力的宿主细胞，其包含本发明的表 达载体。在另一个实施方案中，本发明包含一种细胞培养物，其包含本发明的有糖基化能 力的宿主细胞。在另一个实施方案中，本发明包含一种药物组合物，其包含本发明的重组FVIII 分子和药学可接受载体。此组合物可以是为贮存而冻干的，而且可以重建成液体用于施用， 其在本领域中是常规的。在又一个实施方案中，本发明包含一种治疗需要FVIII疗法的患者的方法，包括 对所述患者施用治疗有效量的本发明的重组FVIII分子。附图简述

图1表明了树突细胞(DC)在体外摄取全长rFVIII和去糖基化的全长 rFVIlKFVIII Degly)。去糖基化前，用异硫氰酸荧光素(FITC)标记rFVIII以通过FACS分 析进行检测。使用Endo-Fl使rFVIII去糖基化60分钟，与DC共培养30分钟，然后清洗。然 后通过FACS分析DC摄取FVIII和FVIII Degly。显示了相对于FVIII摄取的FVIII Degly 摄取，其中FVIII摄取是100%。实施比较FVIII Degly与FVIII的非配对学生(student's) T检验；**对于FVIII而言ρ < 0.01。图 2 显示了 B 域缺失型 FVIII (BDD)、和三种 BDD 突变蛋白(N239Q、N2118Q、N239Q/ N2118Q)的活性m和浓度QB)。所使用的命名显示了指示位置处的氨基酸取代，例如 N239Q指明用谷氨酰胺取代分子中氨基酸位置239处的天冬酰胺。用编码N239Q、N2118Q、 和N239Q/N2118Q的BDD突变体构建体分开转染HKBll细胞。表达蛋白质后，通过生色测定 法OA)来对条件化培养基测定活性，并在转染后96小时时通过ELISAQB)来测定浓度。图3显示了树突细胞(DC)摄取全长rFVIII、B域缺失型FVIII(BDD)、和N-糖基化 位点 BDD单一 (N2118Q)、和双突变蛋白质(N239Q/N2118Q)。将DC 与 FVIII、BDD、BDDN2118Q、 或BDD N239Q/N2118Q于4°C (4C)和37°C (37C)共培养30分钟。然后清洗细胞，并通过 ELISA 来测量细胞提取物中的 FVIII、BDD、BDD N2118Q、和 BDD N239Q/N2118Q 的浓度(pM)。 实施比较N2118Q和N239Q/N2118Q与FVIII和BDD的非配对学生T检验；**对于FVIII和 BDD两者而言ρ <0.01。图4显示了 FVIII特异性T细胞克隆BO1-4针对N2118Q的IFNy (4A)和增殖性 (4B)响应降低。简言之，将FVIII、BDD、或N2118Q与DC—起温育对小时，之后与FVIII特 异性T细胞克隆共培养。M小时后通过ELISA来测量IFN γ响应。6天后通过检查3H-胸 苷掺入来测量增殖性响应。实施比较N2118Q与FVIII和BDD的非配对学生T检验；**对 于FVIII和BDD两者而言ρ <0.01。发明详述要理解的是，本发明不限于所描述的具体方法、方案、细胞系、动物种或属、构建 体、和试剂，并且因此可以有所变化。还要理解的是，本文中所使用的术语是仅为了描绘具 体的实施方案，而且并不意图限制本发明的范围，其仅会被所附权利要求书限制。必须注意到，如本文中和所附权利要求书中所使用的，除非上下文另有明确规定， 单数形式“一个”、“一种”、和“所述”包括复数提及物。如此，例如，提及“氨基酸”指提及一个/种或多个/种氨基酸，包括本领域技术人员已知的其等同物等。除非另有定义，本文中所使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技 术人员的通常理解具有相同的意义。虽然可以在本发明的实践或测试中使用与本文中所描 述的那些方法、装置、和材料相似或等同的任何方法、装置、和材料，但是现在描述优选的方 法、装置和材料。在此为了描述和公开而将本文中所提及的所有出版物和专利收入本文，例如，可 结合目前所描述的发明使用的出版物中所描述的构建体和方法。上文所讨论的和遍及整个 文本的出版物仅提供用于本申请的申请日前的其公开内容。然而，凭借在先发明，本文中的 任何文字都不应解释为承认本发明没有资格早于所述公开。定义为了方便起见，下文提供了说明书、例子、和所附权利要求书中所采用的某些术语 和短语的意义。因子VIII(FVIII)是一种由肝合成并释放入血流中的糖蛋白。由凝血酶激活后， 它与复合物解离以与凝固级联中的其它凝固因子相互作用，这最后导致形成血栓。人全长 FVIII具有氨基酸序列SEQ ID NO :1，虽然等位变体是有可能的。要理解的是，此定义包括 天然的以及重组形式的FVIII。术语“突变蛋白质”和“变体”在提及本申请的多肽时指保 留生物学功能或活性的突变蛋白质和多肽变体。如本文中所使用的，B域缺失型FVIII (BDD)的特征在于具有含有FVIII B域的几 乎(all but) 14个氨基酸的缺失的氨基酸序列。B域的前4个氨基酸(SFSQ，SEQ ID NO: 2)与 B 域的后 10 个残基(NPPVLKRHQR, SEQ ID NO 3)连接(Lind 等，Eur. J. Biochem. 232 19-27,1995)。本文中所使用的BDD具有氨基酸序列SEQ ID NO :4。BDD多肽的例子记载于 美国公开的专利申请号20060115876A1，通过提及而将其收入本文。如本文中用于描述FVIII分子的，“突变”指在编码N-连接的糖基化序列基序的核 酸中产生编码突变蛋白质中的至少一处氨基酸差异，而且除去糖基化基序，并且由此阻止 N-连接的糖基化在突变分子中的所述基序处发生的至少一处取代。术语“突变”还包括源 自于突变核酸的改变的基序。在随后的例子中，突变蛋白质以本领域中常规的方式命名。用于命名突变体的约 定基于如SEQ ID NO :1中所提供的成熟的、全长FVIII的氨基酸序列。例如，突变N239Q指 明氨基酸位置239处的天冬酰胺已经改变为谷氨酰胺。作为一个例子，FIX突变蛋白可以含有氨基酸的保守取代。保守取代在本领域中 公认为用一种氨基酸替换另一种具有相似特性的氨基酸，并且包括例如丙氨酸变化为丝氨 酸；精氨酸变化为赖氨酸；天冬酰胺变化为谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸变化为谷氨酸；谷 氨酰胺变化为天冬酰胺；谷氨酸变化为天冬氨酸；甘氨酸变化为脯氨酸；组氨酸变化为天 冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸变化为亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸变化为缬氨酸或异亮氨酸； 赖氨酸变化为精氨酸；甲硫氨酸变化为亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸变化为酪氨酸、亮氨 酸或甲硫氨酸；丝氨酸变化为苏氨酸；苏氨酸变化为丝氨酸；色氨酸变化为酪氨酸；酪氨酸 变化为色氨酸或苯丙氨酸；和缬氨酸变化为异亮氨酸或亮氨酸。特定氨基酸的单字母缩写、其相应的氨基酸、和三字母缩写如下A，丙氨酸 (Ala) ；C，半胱氨酸(Cys) ；D，天冬氨酸(Asp) ；E，谷氨酸(Glu) ；F，苯丙氨酸(Phe) ；G，甘氨酸(Gly) ；H，组氨酸(His) ；I，异亮氨酸(Ile) ；K，赖氨酸(Lys) ；L，亮氨酸(Leu) ；M,甲硫氨 酸(Met) ；N，天冬酰胺(Asn) ；P，脯氨酸(Pro) ；Q，谷氨酰胺(Gln) ；R，精氨酸(Arg) ；S，丝氨 酸(Ser) ；T，苏氨酸(Thr) ；V，缬氨酸(Val) ；W，色氨酸(Trp) ；Y，酪氨酸(Tyr)；和正亮氨酸 (Nle)。如本文中所使用的，蛋白质和多肽是同义词。多肽的糖基化通常是N-连接的或0-连接的。N-连接的指将碳水化合物模块附接 于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列Asn-X-Ser和Asn-X-Thr ( “N-X-S/T”)(其中X是除脯 氨酸外的任何氨基酸)是用于将碳水化合物模块酶促附接于Asn侧链的识别序列。如此， 多肽中这些三肽序列(或基序)之任一的存在创建潜在的N-连接的糖基化位点。因为这些序列基序(N-X-S/T)是N-连接的糖基化必需的，所以数种不同类型的突 变可以阻止这些位点处N-连接的糖基化。这些突变包括例如，天冬酰胺残基(N)被另一种 残基取代、用脯氨酸取代第二残基(X)、或用除丝氨酸或苏氨酸外的任何氨基酸取代第三残 基(S/T)。N-连接的糖基化序列基序中的某些取代不会阻止基序内的糖基化，例如用丝氨酸 取代第三位的苏氨酸。熟练技术人员可以容易地确定哪些取代会或者不会阻止糖基化在突 变糖基化位点处发生。在一个实施方案中，突变可以是基序(N-X-S/T)第1位的天冬酰胺残基被相似氨 基酸诸如谷氨酰胺的残基取代。通过在N-连接的糖基化位点中用谷氨酰胺残基替换天冬 酰胺残基，有可能抑制这些位点处的糖基化，同时一般维持天然分子在这些位置处的极性 和亲水性(hydropathy)。在另一个实施方案中，突变是在第239位用谷氨酰胺残基取代天冬酰胺(N239Q)。 在另一个实施方案中，突变是第2118位用谷氨酰胺残基取代天冬酰胺(N2118Q)。在别的实 施方案中，突变是第239位和第2118位用谷氨酰胺残基取代天冬酰胺(N239Q/N2118Q)。本发明的rFVIII分子可以或是全长FVIII分子或是其功能性变体，只要该分子含 有阻止序列基序之一(one of the sequence motifs)的糖基化在FVIII分子的氨基酸位 置41-43、239-241、582-584、1810-1812、和2118-2120处发生的突变。任选地，可以在其它 氨基酸位置处突变FVIII分子，只要活性得到保留。FVIII分子中的突变不应将半胱氨酸残 基引入突变蛋白质中，因为半胱氨酸残基可以导致不想要的反应(包括半胱氨酸键)的形 成。在一个实施方案中，FVIII分子是B域缺失型变体(BDD)，其中已经部分地或完全 地使B域缺失。BDD可以保留B域中找到的一个或多个N-连接的糖基化位点(参见例如美 国专利号4，868，112和EP 4910)。在另一个实施方案中，BDD缺乏基本上整个B域。“基 本上整个”指至少涵盖B域内的所有已知糖基化位点的区域。BDD的此实施方案的例子是 具有已经使FVIII B域的几乎14个氨基酸缺失的氨基酸序列的BDD FVIII分子。B域的前 4个氨基酸与B域的后10个残基连接(参见例如美国公开的申请号20060115876)。或者， BDD可以缺乏整个B域(参见例如美国专利号6，130，203)。氨基酸序列变化可以通过多种技术来实现，例如，通过位点特异性诱变来修饰相 应的核酸序列。用于位点特异性诱变的技术是本领域中公知的，并且记载于例如^ller等 (DNA 3 :479-488,1984)或 Horton 等(Gene 77 :61-68,1989，第 61 页-第 68 页)。例如，可以使用 Stratagene cQuickChangeTM II定点诱变试剂盒 (Stratagene Corporation, La
Jolla, California)来突变FVIII核苷酸序列。可以通过DNA测序来确认成功的诱变，并 可以将含有突变的合适片段转移入赋予对例如潮霉素B (Hyg B)的抗性的哺乳动物表达载 体中的FVIII主链中。转移后，可以再次对突变进行序列确认。如此，使用FVIII的核苷 酸和氨基酸序列，可以引入挑选的改变。同样地，使用特异性引物使用聚合酶链式反应来制 备DNA构建体的方法是本领域技术人员公知的(参见例如PCR Protocols, 1990，Academic Press, San Diego, California, USA)。也可以通过建立的标准方法(例如Beaucage等(Gene Amplif. Anal. 3 :1-26, 1983)描述的亚磷酰胺方法)合成制备编码FVIII的核酸构建体。依照亚磷酰胺方法，将寡 核苷酸在例如自动DNA合成仪中合成，纯化，退火，连接，并在合适的载体中克隆。也可以通 过使用特异性引物进行的聚合酶链式反应来制备编码FVIII的DNA序列，例如，如记载于美 国专利号4，683，202 ；或Saiki等(Science 239 :487-491,1988)的。此外，核酸构建体可 以是混合的合成的和基因组的、混合的合成的和cDNA、或混合的基因组的和cDNA起源的， 其通过依照标准的技术连接与整个核酸构建体的各部分对应的合成的、基因组的、或cDNA 起源(在适当时)的片段来制备。可以使用重组DNA方法来将编码FVIII的DNA序列插入重组载体中。载体的选择 通常会取决于要导入载体的宿主细胞。载体可以是自主复制型载体或整合型载体。自主复 制型载体以染色体外实体存在，而且其复制不依赖于染色体复制，例如质粒。整合型载体是 整合入宿主细胞基因组中并与已经将其整合的染色体一起复制的载体。载体可以是表达载体，其中编码经修饰的FVIII的DNA序列与转录、翻译、或加工 DNA所需要的别的区段，诸如启动子、终止子、和多聚腺苷酸化位点可操作连接。一般而言， 表达载体可以源自质粒或病毒DNA，或者可以含有这两者的元件。术语“可操作连接”指明 排列区段以使它们为了其预期目的而一致地发挥功能，例如，转录在启动子中启动，并在整 个编码多肽的DNA序列中继续进行。用于表达FVIII的表达载体可以包含能够指导克隆基因或cDNA转录的启动子。 启动子可以是在挑选的宿主细胞中显示转录活性的任何DNA序列，而且可以源自编码对于 宿主细胞而言同源的或异源的蛋白质的基因。用于指导DNA在哺乳动物细胞中转录的启动 子的例子是例如，SV40 启动子(Subramani 等，Mol. Cell Biol. 1 :854-864,1981) ,MT-I (金 属硫蛋白基因)启动子(Palmiter 等，Science 222 :809_814，1983)、CMV 启动子(Boshart 等，Cell41 :521-530,1985)、或腺病毒 2 主要晚期启动子(Kaufman 等，Mol. Cell Biol, 2 1304-1319，1982)。若必要的话，也可以将编码FVIII的DNA序列可操作连接至合适的终止子(参见 例如 Palmiter 等，Science 222 :809-814,1983 ；Alber 等，J. Mol. Appl. Gen. 1 :419-434, 1982 ；McKnight等，EMBO J. 4 =2093-2099,1985)。表达载体还可以含有位于插入位点下游 的多聚腺苷酸化信号。多聚腺苷酸化信号包括来自SV40的早期或晚期多聚腺苷酸化信号、 来自腺病毒5ΕΛ区的多聚腺苷酸化信号、人生长激素基因终止子(DeNoto等，Nucl. Acids Res. 9 :3719-3730,1981)。表达载体还可以包含增强子序列，诸如SV40增强子。用于连接编码FVIII或FVIII突变蛋白的DNA序列、启动子、终止子、和任选地其 它序列和用于将它们插入含有对于复制必要的信息的合适载体中的方法是本领域技术人员公知的(参见例如 Sambrook等,Molecular Cloning :ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989)。可以将含有编码FVIII突变蛋白的核酸的合适表达载体导入有糖基化能力的细 胞中。然后可以通过ELISA来测定FVIII表达，并可以使用常规的测定法诸如Coatest生 色测定法(diaPharma, West Chester, Ohio)来测定活性。转染哺乳动物细胞并表达导入细胞中的DNA序列的方法记载于例如Kaufman等 (J. Mol. Biol. 159 :601-621,1982) ；Southern 等(J. Mol. Appl. Genet. 1 :327-341,1982)； Loyter 等，(Proc. Natl .Acad. ki. USA 79 :422-426,1982) ；Wigler 等，(Cell 14:725-731， 1978) ；Corsaro 等，(Somatic Cell Genetics 7 :603-616,1981), Graham 等，(Virology 52 :456-467,1973)；及 Neumann 等，(EMBO J. 1 :841-845,1982) 可以通过例如脂转染、 DEAE-右旋糖苷介导的转染、微注射、原生质体融合、磷酸钙沉淀、逆转录病毒投递、电穿孔、 声穿孔(sonoporation)、激光照射、磁转染(magnetofection)、天然转化、和生物射弹转化 来将克隆的DNA序列导入培养的哺乳动物细胞中(参见例如Mehier-Humbert等，Adv. Drug Deliv. Rev. 57 :733_753，2005)。为了鉴定并选择表达外源DNA的细胞，一般与感兴趣的基 因或cDNA —起将赋予可选择表型(选择标志)的基因导入细胞中。选择标志包括例如，赋 予对药物诸如新霉素、嘌呤霉素、潮霉素(潮霉素B，Hyg B)、和甲氨蝶呤的抗性的基因。选 择标志可以是可扩增选择标志，其容许扩增标志物和外源DNA(在连接所述序列时)。例示 性的可扩增选择标志包括二氢叶酸还原酶(DHFR)和腺苷脱氨酶。选择合适的选择标志是 在本领域技术人员的范围内的(参见例如美国专利号5，238，820)。用DNA转染细胞后，将它们在合适的培养基中培养以表达感兴趣的基因。如本文 中所使用的，术语“合适的培养基”指含有细胞生长和FVIII或FVIII突变蛋白表达所需要 的营养物和其它成分的培养基(参见例如美国专利号5，171，844 ；5, 422，250 ；5, 422，260 ； 5，576，194 ；5，612，213 ；5，618，789 ；5，804，420 ；6，114，146 ；6，171825 ；6，358，703 ； 6，780，614 ；及 7，094，574)。培养基一般包含例如碳源、氮源、必需氨基酸、必需糖类、维生素、盐类、磷脂、蛋白 质、和生长因子。然后应用药物以选择以稳定的方式表达选择标志的细胞的生长。对于已 经用可扩增选择标志转染过的细胞，可以提高药物浓度以选择克隆序列的拷贝数目升高， 由此提高表达水平。然后对稳定转染细胞的克隆筛选FVIII或FVIII突变蛋白的表达。例如，可以在具有50 μ g/mL Hyg B的选择压力下在补充有5% FBS的生长培养基 中放置经转染的细胞。选择Hyg B抗性集落，并对其筛选FVIII表达。然后使稳定的转化 子适应于培养基以重组表达。FVIII突变蛋白的生成和表达记载于数份出版物(参见例如 美国公布的申请号 20060115876 ；Kaufman 等，JBiol Chem 263 :6352-6362,1988 ；Hironaka 等，J Biol Chem 267 :8012-8020,1992) 用于本发明的哺乳动物细胞系的例子是C0S-1 (ATCC CRL 1650)、幼仓鼠肾(BHK)、 HKBll 细胞(Cho 等，J. Biomed. Sci, 9 :631-638,2002)、和 HEK-293 (ATCC CRL 1573 ；Graham 等，J. Gen. Virol. 36 :59-72,1977)细胞系。另外，可以在本发明内使用许多其它细胞系， 包括大鼠H印I (大鼠肝癌；ATCC CRL1600)、大鼠H印II (大鼠肝癌；ATCC CRL 1548)、 TCMK-I(ATCC CCL 139)、H印-G2(ATCC HB 8065)、NCTC 1469 (ATCC CCL 9. 1),CH0-K1(ATCC CCL61)、禾口 CHO-DUKX 细胞(Urlaub 禾口 Chasin，Proc. Natl. Acad. Sci. USA77 :4216-4220,1980)。某些细胞系能够使重组蛋白糖基化，并且在本文中称为“有糖基化能力的”细胞 系。有糖基化能力的细胞系的一个例子是HKB11，其可获自美国典型培养物保藏中心(ATCC 编号CRL-12568)。可用于本发明的其它有糖基化能力的细胞系包括C0S_1、CH0、HEK293、和 MlK细胞。将包含含有编码FVIII突变蛋白的核酸序列的宿主细胞的重组培养物在合适的 条件下培养以表达并回收突变蛋白质。在一个实施方案中，FVIII突变蛋白可以由宿主细 胞以分泌形式表达，自生长培养基回收，并任选地进一步纯化以生成药用产物。可以从细胞培养基回收FVIII多肽，然后可以通过本领域中已知的多种方法来纯 化所述FVIII多肽，所述方法包括但不限于层析(例如离子交换、亲和力、疏水性、层析聚 焦、和大小排阻)、电泳方法(例如制备等电聚焦(pr印arative isoelectric focusing, IEF)、差别溶解度(例如硫酸铵沉淀))、提取(参见例如ftOtein Purification, Janson 和Lars Ryden编，VCH Publishers, New York，1989)，或其各种组合。在一个例示性的 实施方案中，可以通过在抗FVIII抗体柱上的亲和层析来纯化多肽。可以通过常规的化 学纯化手段，诸如高效液相层析来实现别的纯化。其它纯化方法是本领域中已知的，而且 可以适用于经修饰的FVIII多肽的纯化(参见例如Scopes, R.，Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y.，1982)。一般而言，“纯化的”应当指已经进行过分级以除去各种其它成分，而且基本上保 留其表达的生物学活性的蛋白质或肽组成。在使用术语“基本上纯化的”的情况中，此名称 应当指如下的组合物，其中蛋白质或肽形成组合物的主要成分，诸如构成组合物中约50%、 约60%、约70%、约80%、约90%、约95%、约99%、或更多的蛋白质。多种用于量化多肽纯化程度的方法是本领域技术人员已知的。这些包括例如测定 活性级分的比活，或通过SDS/PAGE分析来评估级分内的多肽量。用于评估级分纯度的例示 性方法是计算级分的比活，与初始提取物的比活比较活性，并且如此计算在本文中通过“倍 值纯化数目”评估的纯度。当然，用于表示活性量的实际单位会取决于特定的测定技术。可以以商业规模生产重组FVIII。可以使用任何合适的培养方法和培养基来在本 发明的方法中培养细胞。合适的培养方法、条件、和培养基是细胞培养领域中公知的。可以 在适当时使用批和连续发酵方法(任意的悬浮和粘附培养)，例如微载体培养方法和搅拌 罐和气升式发酵罐。可以在任何类型的培养设备诸如发酵容器中培养宿主细胞。可以将细 胞以粘附细胞培养物或悬浮细胞培养物培养。用于表达重组蛋白的细胞的悬浮细胞培养的 设备是熟练技术人员熟悉的(参见例如美国专利号7, 294，484 ；7, 157，276 ；6, 660，501 ；及 6，627，426)。一般而言，用于不依赖贴壁悬浮细胞培养的原则、方案、设备、和实践技术可 以参见 Chu 等(Curr Opin Biotechnol 12 180-7，2001)和 Warnock 等(Biotechnol Appl Biochem 45 :1-12,2006)。用于培养细胞的培养基可以包含各种已知的且可用的生长培养基。可以使用补充 有血清的或没有血清的培养基。为了生产治疗性蛋白质，培养基可以是没有血清的和/或 没有蛋白质的培养基(参见例如美国专利号5，804，420和7，094，574 ；WO 97/05240 ’及EP 0872487)。药物组合物
本发明还关注用于胃肠外施用的药物组合物，其包含治疗有效量的本发明的 FVIII突变蛋白和药学可接受载体。药学可接受载体是可以添加至活性成分以帮助配制或 稳定化制剂，而且对患者不引起显著不利毒物学效果的物质。短语“药学或药理学可接受 的”指在对动物或人施用时不产生不利的、变态反应的、或其它不适当的反应的分子实体和 组合物。如本文中所使用的，“药学可接受载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、涂层物质、 抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。对药学活性物质使用此类介质和药剂是本 领域中公知的。也可以将补充的活性成分掺入组合物中。本发明的组合物包括典型的药物制剂。依照本发明的这些组合物的施用可以经由 任何常见的路径。可以通过任何常规的方法(例如通过静脉内、皮内、肌肉内、皮下、或经皮 投递)来将药物组合物导入受试者中。治疗可以由单剂或一段时间里的多剂组成。适合用于可注射使用的药学形式包括无菌水溶液或分散体和供即时制备无菌可 注射溶液或分散体用的无菌粉剂。所述形式应当是无菌的，而且应当是流体的，其程度使得 存在容易的可注射性。它在制造和贮存条件下应当是稳定的，而且应当针对微生物诸如细 菌和真菌的污染作用提供防护。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇 (例如甘油、丙二醇、和液态聚乙二醇等)、蔗糖、L-组氨酸、Polysortate 80、或其合适的混 合物、和植物油。可以例如通过使用涂层诸如卵磷脂、在分散体的情况中通过维持所要求的 粒度、及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟 苯甲酸酯、氯丁醇、酚、抗坏血酸、硫柳汞等)可以实现阻止微生物的作用。可注射组合物可 以包含等张剂(例如糖类或氯化钠)。可以通过在组合物中使用延迟吸收的药剂(例如单 硬脂酸铝和明胶)来引起可注射组合物的吸收延长。FVIII药物组合物还可以包括填充剂、稳定剂、缓冲剂、表面活性剂、氯化钠、钙盐、 和其它赋形剂。这些赋形剂可以选择为使FVIII在冻干的制剂和液体配制剂中的稳定性最 大化。填充剂可以包括例如甘露醇、甘氨酸、丙氨酸、和羟乙基淀粉(HEQ。稳定剂可以包 括糖诸如蔗糖、海藻糖、和棉子糖、糖醇诸如山梨糖醇和甘油、或氨基酸诸如精氨酸。缓冲剂可以存在于这些配制剂中，因为FVIII分子可以受到冻干过程中pH变化 不利地影响。PH在冻干过程中可以维持于6-8的范围中，例如，于pH约7。缓冲剂可以 是任何生理学可接受化学实体或化学实体组合，其具有起缓冲剂作用的能力，包括组氨酸、 Tris、BIS-Tris 丙烷、1，4_ 哌嗪二乙磺酸(PIPES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、4_ (2-羟 乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)，2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、和N-[氨甲酰甲基]-2-氨基 乙磺酸(ACES)。可以如下制备无菌可注射溶液，即根据需要在具有上文所列举的多种其它成分的 合适溶剂中掺入需要量的活性化合物(例如FVIII突变蛋白)，接着过滤灭菌。一般而言，通过将各种灭菌的活性成分掺入无菌媒介中来制备分散体，所述无菌 媒介含有基础分散介质及来自那些上文所列举的成分的其它所需成分。在供制备无菌可注 射溶液用的无菌粉剂的情况中，制备方法包括例如自其先前无菌过滤的溶液产生活性成分 和任何其它想要成分的粉末的真空干燥和冷冻干燥。配制后，可以以与剂量配制剂相容的方式和以诸如治疗有效的量来施用溶液。“治 疗有效量”在本文中用于指在血流中或在靶组织中提供想要水平的多肽所需要的多肽量。精确量会取决于多种因素，例如特定的FVIII突变蛋白、治疗性组合物的成分和物理特征、 预期的患者群体、投递模式、个体患者考虑等，而且本领域技术人员可以基于本文中所提供 的信息来容易地确定。可以以多种剂量形式诸如可注射溶液等来容易地施用配制剂。对于水溶液中的胃 肠外施用，例如若必要的话，应当适当地使溶液缓冲，并首先用足够的盐水或葡萄糖给予液 体稀释剂等张。这些特定的水溶液特别适合于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内施用。可以通过本领域中公知的任何方法(参见例如Remington，sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，第 20 版，2000)来制备适合于皮下、静脉内、 肌肉内等的配制剂；合适的药用载体；及用于配制和施用的技术。FVIII的药物组合物的例子披露于例如美国专利号5，047，249、5，656，289、 5，665，700,5, 690，954,5, 733，873,5, 919，766,5, 925，739,6, 835，372、及 7，087，723。治疗方法基于用于测定用于治疗哺乳动物中的上文所鉴定状况的功效的公知测定法，并通 过比较这些结果与用于治疗这些状况的已知药物的结果，可以容易地确定本发明突变蛋白 质的有效剂量来治疗每种想要的适应症。要在治疗这些状况之一中施用的活性成分量可以 随诸如所采用的特定多肽和剂量单位、施用模式、治疗期间、所治疗患者的年龄和性别、和 所治疗状况的性质和程度等考虑因素而广泛变化。可以经由使用已建立的用于测定血液凝固水平的测定法连同相关的剂量响应数 据来确定合适的剂量。主治医生可以考虑修饰药物作用的因素，例如药物的比活、损伤的严 重性、和患者的响应性、患者的年龄、状况、体重、性别和饮食、任何感染的严重性、施用的时 间、和其它临床因素来确定最终的剂量方案。可以使用本文中所描述的组合物来治疗与FVIII的功能性缺陷或FVIII缺乏诸如 FVIII的结合特性改变、FVIII的遗传缺陷、和FVIII的降低的血浆浓度有关的任何出血病 症。FVIII的遗传缺陷包含例如编码FVIII的核苷酸序列中碱基的缺失、添加、和/或取代。 在一个实施方案中，出血状况可以是血友病。此类出血病症的症状包括例如严重鼻出血、口 粘膜出血、关节血肿(hemarthrosis)、血肿、持续性血尿、胃肠出血、腹膜后出血、舌/咽后 出血、颅内出血、和外伤相关出血。本发明的组合物可以用于预防性应用。在一些实施方案中，可以对易感疾病状态 或损伤或者在其它情况中有疾病状态或损伤风险的受试者施用FVIII突变蛋白以增强受 试者自身的凝固能力。此量可以定义为“预防有效剂量”。为了预防而施用FVIII突变蛋白 包括如下情况，其中罹患血友病的患者要经历手术，并在手术前1-4小时施用多肽。另外， 多肽适合于用作针对不受控制的出血的预防剂，任选地在没有血友病的患者中。如此，例 如，可以在手术前对有不受控制的出血的患者施用多肽。在本发明的一个实施方案中，可以将FVIII突变蛋白的药物组合物静脉内输注入 患者中以治疗血友病患者中由于FVIII缺乏所致不受控制的出血(例如关节内、颅内、或胃 肠出血)。作为一个例子，可以使用FVIII的体外促凝剂活性来计算在人患者中输注的 FVIII 剂量(Lusher 等，New Engl J Med 328 :453-459,1993 ；Pittman 等，Blood79 389-397，1992 ;Brinkhous 等，Proc Natl Acad Sci 82:8752-8755,1985)。在一个实施方案中，要经由施用FVIII突变蛋白在患者中达到的血浆FVI11水平可以在30-100%的正常 水平的范围内。在另一个实施方案中，组合物可以以范围为约5至50个单位/kg体重、或范围为 10-50个单位/kg体重的剂量、或以20-40个单位/kg体重的剂量静脉内给予。根据需要， 治疗可以采用组合物的单次静脉内施用或延长的一段时间里周期性或连续性施用的形式。 时间间隔频率在约8至对小时(在严重受累的血友病患者中)的范围中，而治疗的持续时 间在1至10天或直至解决出血事件的范围中。本发明的FVIII突变蛋白也可以在体内表达，即这些突变蛋白质可以用于基因疗 法。可以用编码FVIII突变蛋白的多核苷酸(DNA或RNA)离体工程化改造细胞，然后向要用 多肽治疗的患者提供经工程化改造的细胞。此类方法是本领域中公知的。例如，可以通过 本领域中已知的方法通过使用含有编码本发明多肽的RNA的逆转录病毒颗粒来工程化改 造细胞。可以使用本领域技术范围内的普通分子生物学和重组DNA技术来分离并纯化要施 用的基因。然后可以将分离的基因插入合适的克隆载体(例如腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、 牛痘、疱疹病毒、杆状病毒和逆转录病毒、细小病毒、慢病毒、噬菌体、粘粒、质粒、真菌载体) 中。要投递的基因的编码序列可以与表达控制序列诸如启动子、增强子、转录和翻译终止位 点、和其它信号序列可操作连接。将治疗性载体投递入患者中可以是直接的(在该情况中，将患者直接暴露于载体 或投递复合物)或间接的(在该情况中，首先在体外用载体转化细胞，然后移植入患者中)。 这两种办法分别称为体内和离体基因疗法。例如，可以通过直接注射裸露的DNA或者通过 使用微粒轰击(例如基因枪)来直接在体内施用治疗性载体。用于潜在地将治疗基因转移至限定的细胞群体的数种方法是已知的(参见例如 Mulligan, Science 260 :拟6_31，1993)。这些方法包括例如1)直接的基因转移(参见例如 Wolff 等，Science 247 :1465-68,1990) ；2)脂质体介导的 DNA 转移(参见例如 Caplen 等， Nature Med 3 :39-46,1995 ；Crystal, Nature Med. 1 15—17，1995 ；Gao 禾口 Huang，Biochem Biophys Res Comm 179 =280-85,1991) ；3)逆转录病毒介导的DNA转移(参见例如Kay等， Science 262 :117-19,1993 ；Anderson, Science 256 :808-13,1992) ；4)DNA 病毒介导的 DNA转移。此类DNA病毒包括腺病毒(例如基于Ad-2或Ad_5的载体)、疱疹病毒(例如基 于单纯疱疹病毒的载体)、和细小病毒(例如基于腺伴随病毒的载体诸如基于AAV-2的载 体)(参见例如Ali等，Gene Therapy 1 =367-84,1994 ；美国专利号4，797，368 ；美国专利 号 5，139,941)。Goldspiel 等(Clin Pharm 12 :488-505,1993) ；Wu 和 Wu(Biotherapy 3 87-95,1991) ；Tolstoshev(Ann Rev Pharmacol Toxicol 32 :573-596,1993)；及 Morgan 禾口 Anderson, (Ann Rev Biochem 62 :191-217,1993)描述了基因疗法的其它方法。可以使用 的本领域中通常已知的关于重组DNA技术的方法记载于Ausubel等(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY,1993) ；Kriegler, (Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY,1990) ；Dracopoli 等， (Current Protocols in Human Genetics,John Wiley & Sons,NY,1994)；及Colosimo等， (Biotechniques 29:314-324,2000)。用于转移感兴趣基因的特定载体系统的选择会取决于多种因素。熟练技术人员 会领会，可以依照此实施方案使用编码本发明多肽的任何合适的基因疗法载体。用于构建此类载体的技术是已知的(参见例如Anderson，Nature392 =25-30,1998 ；Verma和Somia， Nature 389 :239_242，1998)。可以使用已知技术来实现载体向靶位点的引入。合适的基因疗法载体包括一种或多种启动子。可以使用的合适的启动子包括但不 限于病毒启动子(例如记载于Miller等，Biotechniques 7 =980-990,1989的逆转录病毒 LTR、SV40启动子、腺病毒主要晚期启动子、呼吸道合胞病毒启动子、B19细小病毒启动子、 和人巨细胞病毒(CMV)启动子)、细胞启动子(例如组蛋白、pol III、和β-肌动蛋白启动 子)、和诱导型启动子(例如MMT启动子、金属硫蛋白启动子、和热休克启动子)。合适启动 子的选择对于本领域技术人员从本文中所包含的教导出发会是显而易见的。可以衍生逆转录病毒质粒载体的逆转录病毒包括但不限于Moloney小鼠白血病 病毒、脾坏死病毒、逆转录病毒诸如劳氏肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽类白血病病毒、长臂 猿白血病病毒、人免疫缺陷病毒、骨髓增殖性肉瘤病毒、和乳房肿瘤病毒。可以使用逆转录 病毒质粒载体以转导包装细胞系以形成生产者细胞系。可以转染的包装细胞的例子包括 但不限于 PE501、PA317、PA12、VT-19-17-H2、和 DAN 细胞系，如记载于 Miller (Human Gene Therapy, 1 :5-14,1990)的。载体可以经由本领域中已知的任何手段来转导包装细胞。此 类手段包括但不限于电穿孔、使用脂质体、和CaPO4沉淀。在一个备选中，可以将逆转录病 毒质粒载体包囊入脂质体中，或与脂质偶联，然后对宿主施用。生产者细胞系生成感染性逆 转录病毒载体颗粒，其包含编码本发明突变蛋白质的核酸序列。然后可以使用此类逆转录 病毒载体颗粒来在体外或在体内转导真核细胞。经转导的真核细胞会表达编码本发明突变 蛋白质的核酸序列。可以转导的真核细胞包括但不限于胚胎干细胞、胚胎癌细胞、以及造血 干细胞、肝细胞、成纤维细胞、成肌细胞、角质形成细胞、内皮细胞、和支气管上皮细胞。在一个实施方案中，在病症诸如血友病的基因疗法中使用编码本发明FVIII突变 蛋白的DNA。依照此实施方案，可以在诊断同时或者诊断后立即对有所需要的患者提供用编 码本发明FVIII突变蛋白的基因疗法。本文中所描述的突变蛋白质、材料、组合物、和方法意图为本发明的代表性例子， 而且要理解的是，本发明的范围不限于例子的范围。本领域技术人员会认可可以用所公开 的多肽、材料、组合物和方法的变型来实施本发明，并且认为此类变型在本发明的范围内。呈现了以下实施例以例示本文中所描述的发明，但不应解释为以任何方式限制本 发明的范围。
实施例为了本发明可以得到更好的理解，列出了以下实施例。这些实施例仅为了例示目 的，而不要以任何方式解释为限制本发明的范围。通过提及而完整收录本文中所提及的所 有出版物。实施例1 树突细胞对FVIII的胞吞测定FVIII糖基化对DC体外摄取的影响。首先标记全长rFVIII以进行FACS分 析，然后去糖基化。为了标记rFVIII以进行FACS分析，将PBS(pH 9)中的6yg异硫氰酸 荧光素(FITC)添加至100 μ g去糖基化的FVIII，并容许于4°C混合2小时。通过在20mM HEPESU50mM NaCl、2%蔗糖、和IOOppmTween -80 (聚乙二醇山梨醇酐单油酸酯)溶液 (pH 7.5)中于4°C使用50K膜2小时进行的透析来除去未偶联的FITC。通过Bradford测定法来量化FVIII浓度，并通过生色测定法来测定FVIII活性。然后使用内切糖苷酶 Fl (Endo-Fl)(其特异性切割N-连接的寡糖而不使蛋白质变性)使经标记的rFVIII酶促 去糖基化。于37°C将rFVIII与Endo-Fl —起温育1小时。将rFVIII注射入50K膜中，并 针对 20mM HEPES、150mMNaCl、2%蔗糖、和 IOOppm Tween -80 的溶液(pH 9)于 4°C透析 2小时。通过Wfestern印迹分析来确认去糖基化。为了生成树突细胞(DC)，将粘附单核细胞在补充有3%人AB血清、20ng/mL GM-CSF 和 10ng/mL IL-4 的 RPMI 1640 培养基(Hyclone/Thermo Scientific, Logan, UT) 中培养5天。通过流式细胞术来确认DC存活。将所有细胞于37°C在具有5% CO2和95% 空气的湿润的细胞培养箱中培养。为了测定rFVIII去糖基化对DC摄取的影响，将DC与去 糖基化的rFVIII —起温育30分钟，并在温育后，通过FACS对其分析DC对FVIII的摄取。 图1显示了 DC对FVIII的摄取在由Endo-Fl去糖基化后显著降低。这些结果显示了 DC对 FVIII的摄取至少部分依赖于N-糖基化，而且进一步提示了摄取是由识别N-连接的未加帽 寡糖的⑶206介导的。实施例2 =FVIII突变蛋白在HKBll细胞中的表达将BDD FVIII和此BDD FVIII的三种突变蛋白在HKBll细胞中表达。BDD FVIII 含有B域的几乎14个氨基酸的缺失，使得B域的前4个氨基酸与B域的后10个残基连接。 一种BDD FVIII突变蛋白含有第239位谷氨酰胺对天冬酰胺的单一取代(N239Q)，另一种含 有第2118位谷氨酰胺对天冬酰胺的单一取代(N2118Q)，而第三种含有这两处突变(N239Q/ N2118Q)。使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA)依照制造商的指令用 BDD FVIII和BDD FVIII突变蛋白表达质粒瞬时转染HKBll细胞。用BDD和BDD突变蛋白质粒 瞬时转染HKBll细胞，并通过生色测定法对来自这些细胞的上清液测试FVIII活性，并通过 ELISA来测试FVIII浓度。发现三种突变蛋白质的比活与在未突变形式中含有各自的糖基 化位点的BDD相似(图2A)。N2118Q突变蛋白展现出与BDD相似的表达水平，而N239Q和 N239Q/N2118Q突变蛋白表达水平分别比BDD低约25%和50% (图2B)。因而，虽然此例示 性系统中的一些突变蛋白质的产量是降低的，但是突变蛋白质以有用的量回收。实施例3 树突细胞对FVIII突变蛋白的摄取降低因为认为树突细胞(DC)对FVIII的摄取是由⑶206与FVIII上的甘露糖结尾的 聚糖的相互作用介导的，如实施例1中所描述的，测试DC摄取N239Q/N2118Q BDD突变蛋白 的能力。如上文所描述的那样制备DC。合并来自两名供体的DC，然后与全长rFVIII、BDD FVIII(实施例2中所描述的)、或N239Q/N2118Q BDD突变蛋白共培养。将细胞在96孔板 的各孔中共培养30分钟。每孔的终体积是100 μ L，而rFVIII、BDD、或突变蛋白质的终浓 度是ΙΟηΜ。然后将平板于37°C温育30分钟。还于4°C进行平行的摄取测定法作为对照。 通过以300g于4°C将平板离心5分钟来使细胞沉淀。吸出培养基，并用冰冷的PBS/10mM EDTA/0. 01 %Tween _80清洗细胞三次。然后通过每孔25 μ L具有蛋白酶抑制剂的 Cytobuster 缓冲液(Novagen，Madisen，WI)于4°C溶解细胞沉淀物达15分钟。以300g将 平板离心 10 分钟，之后进行 ELISA。对于 ELISA (American Diagnostica, Stamford, CT)， 将细胞提取物稀释1/25。自重组蛋白产生FVIII和BDD的标准曲线(80至1. 25 μ molar)。 依照制造商的指令进行ELISA。
图3显示了 DC对N2118Q突变蛋白和N239Q/N2118Q FVIII突变蛋白的摄取显著 低于rFVIII和BDD的。在BDD 2118Q的一项药动学研究中，以0. 05mg/kg将BDD N2118Q突变蛋白血管内 注射入雄性Sprague Dawley大鼠(n = 4)中。在多个时间点时抽取血液样品，并通过^Onm 处的吸光度来测量BDD N2118Q的浓度。单一突变体在大鼠中的半衰期是4. 4士0. 7小时， 这与BDD相似。实施例4 =FVIII特异性T细胞克隆的体外IFNy响应降低为了测试N2118Q摄取的降低是否导致针对FVIII的T细胞活性降低，测试FVIII 特异性T细胞克隆Β01-4分泌IFN γ (图4Α)。将HLA匹配的DC与FVIII、BDD,或N2118Q 于37°C在自体血浆中一起温育24小时以使DC能够摄取、加工、和呈递每种蛋白质。然后于 37°C将DC与FVIII特异性T细胞克隆(10 1比率的T细胞DC)共培养M小时。然后 收集上清液(50 μ L)，并稀释两倍以通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)来测量IFN γ。实施例5 =FVIII特异性T细胞克隆的体外增殖性响应降低为了测试N2118Q摄取的降低是否导致响应FVIII的T细胞增殖降低，测试FVIII 特异性τ细胞克隆Β01-4分泌IFN γ (图4Β)。将HLA匹配的DC与FVIII、BDD,或N2118Q 于37°C在自体血浆中一起温育M小时以使DC能够摄取、加工、和呈递每种蛋白质。然后于 37°C将DC与FVIII特异性T细胞克隆(10 1比率的T细胞DC)共培养。在第3天，再 添加20 μ Ci 3Η-胸苷(胸苷)达36小时。收获细胞，并测试胸苷掺入。图4々和图48显示了肌1-411细胞克隆针对拟1180的正^^和增殖性响应显著降 低。这些数据支持如下的想法，即DC摄取N2118Q降低导致DC将FVIII肽呈递至FVIII特 异性T细胞克隆的能力减少。通过提及而将上述说明书中所提及的所有出版物和专利收入本文。本发明所描述 的方法的各种修饰和变型在不偏离本发明范围和精神的前提下对于本领域技术人员会是 显而易见的。虽然已经结合具体的实施方案描述了本发明，应当理解的是，如要求保护的发明 不应过度限于此类具体的实施方案。实际上，意图对于生物化学领域或相关领域中的技术 人员显而易见的用于实施本发明的上述模式的各种修饰在所附权利要求书的范围内。本领 域技术人员会认可或者仅仅使用常规实验便能够确定本文中所描述发明的具体实施方案 的许多等同方案。意图此类等同方案被所附权利要求书所涵盖。
权利要求
1.重组因子VIII分子，其包含已经通过在一个或多个天然存在的N-连接的糖基化位 点氨基酸序列内引入一处或多处氨基酸突变来修饰的氨基酸序列，其中所述突变阻止所述 N-连接的糖基化位点被糖基化。
2.权利要求1的重组因子VIII分子，其中所述N-连接的糖基化位点氨基酸序列选自 下组因子 VIII 分子的氨基酸位置 41-43、239-241、582-584、1810-1812、和 2118-2120。
3.权利要求2的重组因子VIII分子，其中所述氨基酸位置是239-M1、1810-1812、和 2118-2120。
4.权利要求2的重组因子VIII分子，其中所述一处或多处氨基酸突变包含第239位、 第1810位、和第2118位的一处或多处氨基酸突变。
5.权利要求2的重组因子VIII分子，其中所述突变包含第239位和第1810位的突变。
6.权利要求2的重组因子VIII分子，其中所述突变包含第239位和第2118位的突变。
7.权利要求2的重组因子VIII分子，其中所述突变包含第1810位和第2118位的突变。
8.权利要求1至7中任一项的重组因子VIII分子，其中所述突变包含取代。
9.权利要求8的重组因子VIII分子，其中所述取代包含用谷氨酰胺取代第239位天冬酰胺。
10.权利要求8的重组因子VIII分子，其中所述取代包含用谷氨酰胺取代第1810位天 冬酰胺。
11.权利要求8的重组因子VIII分子，其中所述取代包含用谷氨酰胺取代第2118位天 冬酰胺。
12.权利要求8的重组因子VIII分子，其中所述取代包含取代N239Q和N2118Q。
13.权利要求1至12中任一项的重组因子VIII分子，其中所述因子VIII分子是B域 缺失型因子VIII分子。
14.一种分离的核酸，其编码权利要求1至13中任一项的重组因子VIII分子。
15.一种表达载体，其包含权利要求14的核酸。
16.一种有糖基化能力的宿主细胞，其包含权利要求15的表达载体。
17.一种细胞培养物，其包含权利要求16的有糖基化能力的宿主细胞。
18.一种药物组合物，其包含权利要求1至13中任一项的重组因子VIII分子。
19.依照权利要求20的组合物，其是为贮存而冻干的，而且可以重建成液体用于施用。
20.一种治疗需要因子VIII疗法的患者的方法，包括对所述患者施用治疗有效量的权 利要求1至13中任一项的重组因子VIII分子或权利要求18的药物组合物。
21.一种通过基因疗法治疗需要因子VIII疗法的患者的方法，包括对所述患者施用包 含编码因子VIII分子的治疗性载体的组合物。
全文摘要
本发明涉及具有降低的N-连接的糖基化和降低的免疫原性的经修饰的因子VIII分子。本发明还涉及使用经修饰的因子VIII分子来例如治疗罹患血友病的患者的方法。
文档编号C12P21/06GK102137935SQ200980132497
公开日2011年7月27日 申请日期2009年6月25日 优先权日2008年6月25日
发明者吴非, 弗雷德.J.阿斯沃德, 朱荧, 理查德.哈金斯, 约翰.E.墨菲, 蒋刘小莱 申请人:拜耳医药保健有限公司