IL-1β抑制剂组合物及其应用
【技术领域】
[0001] 总体上，本发明涉及生物制药领域以及它们在与炎性疾病（例如类风湿性关节 炎、克罗恩病等）、糖尿病、心血管疾病和痛风相关的情况中的应用。更具体地，本发明涉及 一种能够抑制IL-Ιβ细胞因子的异源二聚体IL-lRl/IL-lRAcP-衍生的组合物。
【背景技术】
[0002] 细胞因子的白细胞介素-l(IL-l)家族包含由人和小鼠中的11个不同基因编码的 11种蛋白质（IL-1F1至IL-1F11)。IL-1-型细胞因子是天然免疫反应的主要介体，并且由白 细胞介素-1受体拮抗剂（IL-1RA)引起的组成成分IL-1或IL-Ιβ的阻断证明了 IL-1在一 些人类自身炎症性疾病中的重要的作用。IL-1或IL-Ιβ在多种不同的细胞类型中快速增 加了数百个基因的信使RNA表达。IL-1和IL-Ιβ的有效促炎活性被限制在三个主要水平 上：⑴合成和释放，（ii)膜受体和（iii)细胞内信号传导。该途径概括了 a-ι或a-ι β 的细胞外和细胞内的信号传导，包括放大或终止IL-1响应的正反馈和负反馈机制。响应 于配体结合受体，组合的磷酸化和泛素化事件的复杂的序列导致激活了核因子kappa-B的 信号传导，以及通过转录和转录后机制、合作地诱导标准IL-1靶基因（例如IL-6、IL-8、 MCP-1、C0X-2、IB、IL-1、IL-1 β、MKP-1)的表达的JNK和p38促分裂原活化蛋白激酶途径。 值得注意的是，参加针对IL-1的细胞响应的大部分细胞内成分也将响应介导至其他细胞 因子（IL-18和IL-33)、Toll样受体（TLRs)和许多形式的细胞毒性压力（参见Weber A等 人，Sci Signal杂志，2010年1月19日；3 (105)，其全部教导以参考引用的方式结合于此）。
[0003] IL-1和IL-1 β独立地结合被泛表达的类型I的IL-1受体（IL-1R1)。第三特定配 体，IL-1受体拮抗剂（IL-1RA)，结合具有类似特异性和亲和力的IL-1RI而不激活受体和触 发下游信号传导。IL-1受体辅助蛋白（IL-lRAcP)充当IL-1/IL-1RI复合物的信号传导所 必需的辅助受体，并且该辅助受体也是由其他IL-1族成员--特别是IL-18和IL-33-- 激活IL-1R1所必需的。类型II的IL-1受体（IL-1R2)结合IL-1和IL-1 β，但缺少有能力 进行信号传导的细胞溶质部分，由此充当诱饵受体。IL-1RA、质膜锚定的IL-1R2和自然出 现的每个细胞外IL-1受体链（称为sIL-lRI、sIL-lRII和sIL-lRAcP，其中"s"表示可溶 性）的"分水岭（shed) "区域提供细胞外间隙中的E-1信号传导的可诱导的负调控因子，由 增加的转录和控制的释放的结合来控制的负调控因子的丰度能够限制或终止IL-1效果。
[0004] IL-1信号转导中的初始步骤是促进IL-lRacP的补充的IL-1RI的第一细胞外区 域中的配体诱导的构象改变。通过称为Toll样和IL-1R样（TIR)区域的保守的细胞溶质 区域，三聚复合物快速地装配两种细胞内信号传导蛋白质、骨髓分化初反应基因88 (MYD88) 和白细胞介素-1受体活化蛋白激酶（IRAK)4。缺少MYD88或IRAK4的小鼠显示出在IL-1 信号传导中的严重缺陷。类似地，具有IRAK4基因中的突变的人在IL-1RI和Toll样受体 (TLR)信号传导中具有缺陷。IL-l、IL-lRI、IL-RAcP、MYD88和IRAK4形成稳定的IL-1诱导 的第一信号传导模块。这与IRAK4的（自）磷酸化并行，其中IRAK4随后将IRAKI和IRAK2磷 酸化，然后接着是肿瘤坏死因子相关因子（TRAF)6的补充和寡聚反应（oligomerization)。 IRAKI和2同时用作衔接子（adaptors)和蛋白激酶，以传送下游信号。IRAKI、IRAK2 和TRAF6的复合物从初始受体复合物中分离，并且缺少这些蛋白质的细胞削弱了核因子 kappa-B(NF-kappa-B)和激活蛋白l(AP-l)的转录因子的活化。
[0005] IL-1的过量产生是许多炎性疾病的原因。例如，IL-1已经与糖尿病、心血管疾病、 痛风和某些类型的关节炎（例如类风湿性关节炎（RA))的病理学关联起来。
[0006] 利洛纳塞（Rilonacept)是包括IL-1-特异性融合蛋白的IL-1诘抗剂，所述 IL-1-特异性融合蛋白包含人ILl-RAcP的细胞外区域的IL-1结合部分、人IL-1RI的 细胞外区域的IL-1结合部分以及多聚化（multimerizing)成分。该IL-1-特异性融 合蛋白在专利号为No.6, 472, 179的美国专利文献、2003年7月31日公开的、公开号为 No. 2003/0143697的美国专利文献、专利号为No. 7, 361，350的美国专利文献以及2005年9 月8日公开的、公开号为No. 2005/0197293的美国专利文献（上述文献在其整体上以参考 引用的方式结合于此）中做出了说明。以ARCALYST为商标名的利洛纳塞被美国食品和药 物管理局（FDA)批准，以用于冷吡啉相关周期性综合征（Cryopyrin-Associated Periodic Syndromes，CAPS)的治疗，包括成人和12岁及以上儿童的家族性冷自主炎症综合征（FCAS) 和马克尔-威尔斯综合征（MWS)。利洛纳塞的进一步的临床试验正在进行，即用于痛风。
【发明内容】
[0007] 提供
【发明内容】
用于以简化形式介绍选择的构思，其将在下文的【具体实施方式】中进 一步说明。本
【发明内容】
既不是为了确定所要求保护的主题的主要特征或基本特征，也不是 为了用于帮助确定所要求保护的主题的范围。
[0008] 在某些方面，本发明提供了一种能够结合人IL-1 β (GenBank:AAH08678. 1)的异源 二聚体蛋白质组合物。该蛋白质组合物包含含有第一氨基酸序列和第二氨基酸序列的第一 多肽，其中第一氨基酸序列含有人IL1-R1的18至333位氨基酸（GenBank:AAM88423. 1)，第 二氨基酸序列含有人免疫球蛋白gamma-lFc的Fc片段的第一突变体（GenBank: J00228. 1)。 该蛋白质组合物还包含含有另一第一氨基酸序列和另一第二氨基酸序列的第二多肽，其中 另一第一氨基酸序列含有人ILl-RAcP的21至358位氨基酸（GenBank:BAA25421. 1)，另一 第二氨基酸序列含有人免疫球蛋白gamma-lFc的Fc片段的第二突变体。在该蛋白质组合物 中，第一和第二突变体被筛选为利于第一与第二突变体之间的异源二聚体组装，而不是任 何同源二聚体组装。该蛋白质组合物能够显示出人IL-Ιβ在酶联免疫吸附法（ELISA)测 定中与约50ng/ml的EC50的结合活性。该蛋白质组合物的第一多肽可以含有SEQ ID NO. 1 的氨基酸序列，而第二多肽可以含有SEQ ID NO. 2的氨基酸序列。
[0009] 在某些方面，本发明提供了一种治疗组合物。该治疗组合物包含能够结合人 IL-Ιβ的异源二聚体蛋白质组合物。该蛋白质组合物包含含有第一氨基酸序列和第二氨 基酸序列的第一多肽，其中第一氨基酸序列含有人IL1-R1的18至333位氨基酸，第二氨基 酸序列含有人免疫球蛋白gamma-lFc的Fc片段的第一突变体。该蛋白质组合物还包含含 有另一第一氨基酸序列和另一第二氨基酸序列的第二多肽，其中另一第一氨基酸序列含有 人ILl-RAcP的21至358位氨基酸，另一第二氨基酸序列含有人免疫球蛋白gamma-lFc的 Fc片段的第二突变体。在该蛋白质组合物中，第一和第二突变体被筛选为利于第一与第二 突变体之间的异源二聚体组装，而不是任何同源二聚体组装。该治疗组合物可以显示出，通 过人Fc ELISA的测定，异源二聚体蛋白质组合物在小鼠皮下注射了 5mg/kg的剂量之后的 体循环中的至少约88小时的半衰期。该治疗组合物可以包含由第一多肽和第二多肽组成 的异源二聚体蛋白质，其中第一多肽含有SEQ ID NO. 1的氨基酸序列，第二多肽可有SEQ ID NO. 2的氨基酸序列。
[0010] 在某些方面，本发明提供了一种编码包含SEQ ID N0. 3的氨基酸序列的多肽的分 离的核酸。该核酸的密码子使用可以被优化为在哺乳动物细胞中的多肽的高表达。该核酸 可以含有SEQ ID N0. 5的序列。该核酸可以包含表达载体。
[0011] 在某些方面，本发明提供了一种编码包含SEQ ID N0. 4的氨基酸序列的多肽的分 离的核酸。该核酸的密码子使用可以被优化为在哺乳动物细胞中的多肽的高效表达。该核 酸可以含有SEQ ID N0. 6的序列。该核酸可以包含表达载体。
[0012] 在某些方面，本发明提供了一种SEQ ID N0. 7的分离的核酸。
[0013] 在某些方面，本发明提供了一种异源表达系统。该表达系统包含表达载体，所述表 达载体包含编码含有SEQ ID N0. 3的氨基酸序列的第一多肽的核酸序列以及另一编码含有 SEQ ID N0. 4的氨基酸序列的第二多肽的核酸序列。该表达系统的表达载体可以包含在哺 乳动物细胞中。哺乳动物细胞可以是CH0细胞。该表达系统能够表达包含含有SEQ ID NO. 1 的氨基酸序列的第一多肽和含有SEQ ID NO. 2的氨基酸序列的第二多肽的异源二聚体蛋白 质。异源二聚体蛋白质的表达水平可以是每升细胞培养物至少300mg。
[0014] 在某些方面，本发明提供了用于制造治疗或预防与人IL-Ιβ的活性的调节有关 的疾病的药物的物质的用途。该物质包含由第一多肽和第二多肽组成的异源二聚体蛋白 质，其中第一多肽含有SEQ ID NO. 1的氨基酸序列，第二多肽含有SEQ ID N0. 2的氨基酸序 列。与人IL-Ιβ的活性的调节有关的疾病可以是关节炎、痛风、类风湿性关节炎、冷吡啉相 关周期性综合征（CAPS)、硬皮病、糖尿病、动脉硬化、干眼症、眼部过敏（ocular allergy) 或葡萄膜炎。
[0015] 在某些方面，本发明提供了一种治疗或预防与人IL-Ιβ的活性的调节有关的疾 病或状况的方法。该方法包含向需要治疗或预防与人IL-Ιβ的活性的调节有关的疾病的 患者给药在治疗上有效量的药物组合物。该药物组合物包含由第一多肽和第二多肽组成的 异源二聚体蛋白质，其中第一多肽含有SEQ ID NO. 1的氨基酸序列，第二多肽含有SEQ ID NO. 2的氨基酸序列。与人IL-Ιβ的活性的调节有关的疾病可以是关节炎、痛风、类风湿 性关节炎、冷吡啉相关周期性综合征（CAPS)、硬皮病、糖尿病、动脉硬化、干眼症、眼部过敏 (ocular allergy)或葡萄膜炎。
[0016] 在某些方面，本发明提供了一种能够结合人IL-Ιβ的异源二聚体蛋白质组合物。 该蛋白质组合物能够响应于用人IL-1 β处理成纤维细胞而抑制在人肺成纤维细胞中产生 人IL-6。该抑制的特征在于IC50值为2. 3ρΜ。
【附图说明】
[0017] 以下附图和说明有助于理解本发明：
[0018] 图1说明性地示出了目前教导的异源二聚体蛋白质组装，其包含通过柔性接头 (flexible linker)与IgG-Fc区域（Fc-II)融合的IL1-R1的细胞外部分，以及通过另一柔 性接头与另一 IgG-Fc区域（Fc-V)融合的ILl-RAcP的细胞外部分；
[0019] 图2示意性地示出了 PKN012质粒的图谱以及本发明的多肽的克隆中所使用的标 注的序列；
[0020] 图3示出了在生成表达本发明的多肽的稳定的细胞系的过程中获得的典型的转 染增长曲线；
[0021] 图4示出了经过阴离子交换色谱法纯化步骤之后的含有包含SEQ ID NO. 1的多肽 和SEQ ID NO. 2的多肽的异源二聚体的样本的体积排阻高效液相色谱法（HPLC)分析色谱；
[0022] 图5示出了经过阴离子交换色谱法纯化步骤之后的含有包含SEQ ID NO. 1的多肽 和SEQ ID NO. 2的多肽的异源二聚体的样本的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)分析；
[0023] 图6示出了使用商业上可获得的人IL-Ιβ在ELISA测定中的含有包含SEQ ID NO. 1的多肽和SEQ ID NO. 2的多肽的异源二聚体的纯化样本的典型结合曲线；
[0024] 图7示出了 IL-6生成测定实验的IL-1抗体介导抑制中所获得的校正曲线；
[0025] 图8示出了 IL-1 β -介导的IL-6生成和从培养基复原的IL-6的结果，其中MRC5 细胞用最终浓度为50pg/ml (IL-1单独）的IL-1 β培养24小时，或者未处理（细胞对照）， 同时未暴露于该细胞的培养基加入了最终浓度为20pg/ml的IL-6,以估算IL-6复原；
[0026] 图9示出了 IL-1 β -介导的IL-6生成和从培养基复原的IL-6的测量结果，其中 MRC5细胞用最终浓度为50pg/ml (IL-1单独）的IL-1 β培养24小时，或者未处理（细胞对 照）。未暴露于该细胞的培养基加入了最终浓度为20pg/ml的IL-6,以估算IL-6复原；
[0027] 图10示出了以当前教导的ILlR-FcV-RAcP-FcII异源二聚体实施的抑制IL-6生 成测定中所获得的校正曲线；
[0028] 图11示出了用ILlR-FcV-RAcP-FcII异源二聚体对IL-1 β -介导的IL-6生成的抑 制测量和从培养基复原的IL-6的结果，其中MRC5细胞用最终浓度为50pg/ml (IL-1单独） 的IL-1 β培养24小时，或者未处理（细胞对照），同时未暴露于该细胞的培养基加入了最 终浓度为30pg/ml的IL-6,以估算IL-6复原（RPH-10+30pg/ml IL6);为确保用于该实验的 两个细胞培养板之间的一致性，IL-1对于从两个板生成的IL-6的效果进行了比较（IL-1单 独并且IL1单独板2,分别对于板1和板2) ;ILlR-FCV-RACP-FcII异源二聚体的最高浓度 (20 μ g/ml对于E-6生成的效果也被检测（RPH-10单独）；对应于204. 8ng/ml的最终浓度 的ILlR-FcV-RAcP-FcII异源二聚体稀释液也被包括，以证明两个板（RPH10板2)之间的数 据的一致性；并且
[0029] 图12示出了用于LIR-FcV-RAcP-FcII异源二聚体实验的滴定曲线测量的结果，其 中MRC5细胞用IL-1 β或以各种浓度的LIR-FcV-RAcP-FcII异源二聚体预先混合的IL-1 β 培养；IL-6生成由Quantakine ELISA测量，并且使用4-参数拟合算法（4-parameter fit algorithm)来分析数据；产生的方程的系数C数量上等于0. 3ng/ml或者约2. 4pM的IC50 值。
【具体实施方式】
[0030] 这里所公开的教导部分基于能够结合至人IL-Ιβ并削弱其功能的异源二 聚体蛋白质组装。当前教导的异源二聚体蛋白质组装包含ILl-Rl(GenBank(基因 库）：AAM88423. 1)和IL-lRAcP(GenBank:BAA25421. 1)的细胞外部分或其功能片段。分 别地，IL1-R 1 部分和 IL-lRAcP 部分融于人 Ig Gamma-1 (GenBank: J00228. 1)的 Fc 段的 不同突变体。异源二聚体蛋白质组装中的两个不同的Fc突变体被设计为利于在两个Fc 突变体之间形成异源二聚体，而不是任何同源组装。为了允许当前教导的异源二聚体蛋 白质组装的重组产生，已经构建了 DNA表达载体，以用于过量产生异源蛋白质表达系统中 的异源二聚体蛋白质组装，并且已经制备了哺乳动物细胞，其以高表达水平稳定地表达异 源二聚体蛋白质组装。已经设计了蛋白质纯化过程，其允许获得当前教导的异源二聚体 蛋白质组装的生理相关的实质上纯的制备。因此，在酶联免疫吸附法（ELISA)中使用人 IL-Ιβ (GenBank:AAH08678. 1)纯化的蛋白质分子证明了高等级的体外比活度。意料之外 地，蛋白质分子展示出基于皮下动物注射的可接受的药代动力学模式，而不导致任何体重 减轻或不良临床事件。
[0031] 本说明书中使用的术语在本发明的语境以及每个术语所使用的特定的语境中，总 体上具有它们在本领域中的普通含义。某些术语在下文或本说明书的别处做出了说明，其 中说明了本发明的组合物和方法以及如何制造并使用它们，以给实施者提供额外的指导。 术语的任何用途的含义在该术语所使用的特定语境中将是明显的。"约"和"近似"应当总 体上表示对于所测量的给出测量的本质或精密度的量的可接受的误差度。一般来讲，示例 性的误差度为给定值或值的范围的百分之20 (% )以内，优选地为10 %以内，并且更优选地 为5 %以内。可选地且特别地，在生物系统中，术语"约"和"近似"可以表示在某一数量级 以内，优选地为给定值的5倍以内，并且更优选地为2倍以内。除非另有说明，这里所给定 的数值量是近似的，当没有明确说明时，可以推测术语"约"和"近似"的含义。
[0032] 本发明的方法可以包括相互比较序列，包括一个或多个突变体（序列变化）的野 生型序列。这种比较一般包含聚合物序列的比对，例如使用本领域中公知的序列比对程序 和/或算法（例如BLAST，FASTA和MEGALIGN，仅举几例）。本领域技术人员可以容易地领 会在这种比对中，其中突变含有残基插入或删除，序列比对将在不含有插入或删除的残留 的聚合物序列中引入"间隙"（一般用破折号或"A"来表示）。
[0033] 本发明的方法包括统计计算，例如IC50或EC50值等的计算。本领域技术人员能 够容易地领会，这可以使用各种商业上可获得的软件来执行，例如PRISM(美国加利福尼亚 州拉荷亚的GraphPad软件股份有限公司生产）或类似物。
[0034] "同源"，在其所有的语法形式和拼写变化中，指的是具有"共同进化起源"的两种 蛋白质一一包括来自相同种类的生物中的超家族的蛋白质以及来自不同种类的生物的同 源蛋白质一一之间的关系。这种蛋白质（以及它们的编码氨基酸）具有如由它们的序列 相似性所反映的序列同源性，不论是根据相同度或通过特定残基或基序以及保守位置的存 在。然而在通常使用以及在当前应用中，术语"同源的"当通过例如"高度"这样的副词修 饰时，可以指的是序列相似度并且可以或者可以不涉及共同的进化起源。
[0035] 术语"序列相似性"，在其所有的语法形式中，指的是或共享或不共享共同的进化 起源核酸或氨基酸序列之间的同一度或一致。
[0036] 术语"蛋白质"和"多肽"被可交换地使用。这里所述的多肽可以由多于一个连续的 氨基酸链组成，由此形成二聚体或其他低聚物形式。一般来讲，用于哺乳动物的当前教导的 多肽以哺乳动物细胞表达，其中哺乳动物细胞允许适当的翻译后修饰，例如C