大麻素的生物合成的制作方法
【技术领域】
[0001 ]本申请案要求2013年2月28日申请的美国临时专利申请案第61/770,766号的优先 权，所述临时专利申请案的内容通过引用并入本文中。
[0002] 本发明涉及大麻素的生物合成。更具体来说，本发明涉及使用蛋白激酶合成酶酶 类离体制造毫克到克或千克量的适于医药和保健食品应用的大麻素的方法，所述酶类负责 在植物中合成大麻素。
【背景技术】
[0003] 大麻素为衍生自大麻(Cannabis sativa)的化合物，大麻为大麻科的一年生植物。 所述植物含有约60种大麻素。大部分熟知的天然存在的大麻素为四氢大麻酚(THC)，其用于 治疗各种医学病况，包括青光眼、AIDS消瘦、神经痛、治疗与多发性硬化症有关的痉挛、肌肉 纤维疼痛以及化学疗法诱发的恶心。另外，已报告THC呈现治疗过敏、发炎、感染、癫痫症、抑 郁症、偏头痛、躁郁症、焦虑症以及药物依赖性和戒断综合症的治疗效果。THC作为抗催吐药 物尤其有效并且投予以控制呕吐，呕吐是使用类鸦片镇痛剂和麻醉剂、高度活性抗反转录 病毒疗法和癌症化学疗法所伴随的常见副作用。
[0004] 大麻素逐渐用于医药和保健食品应用。用于此类应用的大麻素化合物几乎完全获 自天然来源，例如植物组织。因此，现有技术披露使用不同溶剂萃取方法从大麻植物的毛状 体获得大麻素化合物。一些与此类方法有关的缺点包括产量差，与植物生长和维持有关的 尚成本以及与植物提取物的提取和纯化有关的成本。植物的安全性还是制造医药级大麻素 化合物的成本附加的重要考虑因素。
[0005] 然而，尤其用于治疗与化学疗法、疼痛有关的恶心和呕吐的大麻素化合物作为刺 激患有消瘦综合症的AIDS患者食欲的药剂以及用于治疗青光眼的药剂的逐渐增加的重要 性已促使本发明者开发离体酶催化的半合成方案来大规模制造大麻素和大麻素类似物。本 发明方法还允许以降低的成本合成大麻素和其类似物。
【发明内容】
[0006] 前述总体描述以及下文的【附图说明】和【具体实施方式】都是示范性以及说明性的，并 且打算提供对所主张的本发明的进一步解释。所属领域的技术人员从本发明的以下详细描 述容易显而易知其它目标、优势和新颖特征。
[0007] -方面，本发明提供一种制造大麻素或大麻素类似物的方法，所述方法通过：
[0008] (a)选择根据式I的化合物；
[0010] (b)选择大麻素合成酶作为将式I化合物转换成大麻素或大麻素类似物的催化剂；
[0011] (C)使式I化合物与大麻素合成酶接触；以及
[0012] (d)分离来自步骤(b)的产物。可以依据这一合成策略将分离的产物脱羧。
[0013] 在式I中，R选自-OH、卤素、-SH或-NRaRb基团。取代基RjPR2各自独立地选自由以下 组成的群组:-H、-C(0)Ra、-0Ra、任选经取代的&-&〇直链或分支链亚烷基、任选经取代的C 2-C10直链或分支链亚烯基、任选经取代的C2-Ciq直链或分支链亚炔基、任选经取代的C 3-C10芳 基、任选经取代的C3-Ciq环烷基、（C 3-Ciq)芳基-(C1-Ciq)亚烷基、（C3-C iq)芳基-(C2-Ciq)亚烯 基以及(C3-C iq )芳基-(C1-Ciq )亚炔基。
[0014] 对于某些式I化合物,RjPR2连同其键结的碳原子一起形成(：5-&()环状环。一方面， C5-Ciq环状环包含一或多个选自氧、硫或氮的杂原子。式I中的R3选自由以下组成的群组： H、-C(O) Ra以及C1-Ciq直链或分支链烷基，而IM5PR b各自独立地是-H ^om-NH2JC1-C10) 直链或分支链烷基或C3-Ciq环烷基。然而，本发明方法不允许四氢大麻酚或大麻二酚的合 成。
[0015] 依据这一策略，大麻素合成酶选自大麻二醇酸合成酶、四氢大麻酚酸合成酶或大 麻环萜酚酸合成酶群组。
其中X选自-OH、-SH或-NRaRb。
[0017] -方面，本发明方法描述大麻素合成酶与固体支撑物的固定。根据上文所述的方 法制造的大麻素和大麻素类似物以单个对映异构体形式存在。这些化合物的对映异构纯度 为至少95 %到至少99 %。
[0018] 根据另一实施例提供制造根据式II的大麻素或大麻素类似物的方法，所述方法通 过：
[0019] (a)使根据式III的化合物与根据式IV的化合物；
[0021]在催化式III化合物与式IV化合物反应的酶存在下反应形成式II化合物；
[0023] (b)使式II化合物与大麻素合成酶接触；
[0024] (C)分离来自步骤(b)的产物；以及
[0025] (d)任选地使来自（c)的产物脱羧获得大麻素或大麻素类似物。
[0026] 取代基R、Ri、R2以及R3如上文所定义并且抱选自由以下组成的群组:直链或分支链 (C1-Ciq )亚烷基、直链或分支链(C2-Ciq )亚烯基、直链或分支链(C2-Ciq )亚炔基、-C (0) - (C1-C10)亚烷基、-C(O)-(C2-C1Q)亚烯基以及-C(O)-(C 2-C1Q)亚炔基。此外，对于式II、111和IV化 合物，任何亚烷基、亚烯基、亚炔基、芳基、芳基亚烷基或环烷基经一或多个选自由以下组成 的群组的基团进一步取代：-〇H、卤素、-NRbRc^-CXC^Rh-CXC^NRUCi-CioH^S^CNjCi-C 4)烷氧基、（C1-C4)卤烷基以及(C1-C4)羟基烷基，并且R a、Rb以及Rc可各自独立地为-m-SH、-NH2、（ C1-Ciq )直链或分支链烷基或C3-Ciq环烷基。
[0027]还提供一种用于制造四氢大麻酚、大麻色素或四氢大麻酚和大麻色素两者或其类 似物的方法，所述方法通过：
[0028] (a)选择根据式V的化合物；
[0030] (b)使式V化合物与四氢大麻酚酸合成酶接触；
[0031] (C)改性包含式V化合物和四氢大麻酚酸合成酶的反应混合物的至少一种特性获 得四氢大麻酚、大麻环萜酚或四氢大麻酚和大麻色素两者或其类似物作为产物。
[0032] 对于式V化合物，R选自-OH、卤素、-SH或-NRaRb基团，RjPR 2各自独立地选自由以下 组成的群组:-H、-C(0)Ra、-0Ra、任选经取代的&-&〇直链或分支链亚烷基、任选经取代的C 2-C10直链或分支链亚烯基、任选经取代的C2-Ciq直链或分支链亚炔基、任选经取代的C 3-C10芳 基、任选经取代的C3-Ciq环烷基、（C3-Ciq)芳基-(C 1-Ciq)亚烷基、（C3-Ciq)芳基-(C2-C iq)亚烯 基以及(C3-Ciq)芳基-(C1-C iq)亚炔基，并且R3选自K(O)R^C1-Ciq直链或分支链烷基。对 于特定化合物，RdPR 2连同其键结的碳原子一起形成C5-Ciq环状环并且取代基RjPRb各自独 立地是-H、-OH、-SH、-NH 2、（ C1-C1Q)直链或分支链烷基或C3-C1Q环烷基。
[0033] 一方面，改性反应混合物的至少一种特性包含改变反应混合物的pH，例如将pH改 为约4.0到约8.0单位的范围内从而控制上述方法制造的四氢大麻酚比大麻色素的比率。
[0034] 本发明技术还提供用于制造大麻素或大麻素类似物的系统。此类系统包含固持培 养基和多个细胞的发酵器，其中细胞被配置成产生和分泌大麻素合成酶;含有反应物的生 物反应器，反应物被配置成与大麻素合成酶相互作用形成第一大麻素和第二大麻素，以及 被配置成控制生物反应器的条件的控制机构。后一控制机构用于相对于第二大麻素形成的 量影响第一大麻素形成的量。
[0035] 所述系统可另外包含被配置成至少部分分离所述多个细胞与所述培养基的过滤 器，使得分离后含有大麻素的培养基引入到生物反应器中。在一个实施例中，多个细胞表现 的酶包括允许酶结合到生物反应器内的镍支撑物的标签。任何式I化合物或大麻砲酸酸都 可以用作酶四氢大麻酚酸合成酶的底物。视生物反应器内的条件而定，四氢大麻酚酸或大 麻环萜酚酸以第一大麻素的形式产生并且第二大麻素将为四氢大麻酚酸和大麻环萜酚酸 中的另一个。
【附图说明】
[0036]图1为用于根据示范性实施例制造大麻素或大麻素类似物的系统的示意性说明。
【具体实施方式】 [0037] 定义
[0038]如本文所用，除非另外规定，否则单数形式"一"和"所述"包括多个参考物。因此， 举例来说，提及"一个/种细胞"包括多个/种细胞，并且提及"一个/种分子"就是提及一或多 个/种分子。
[0039]如本文中所用，"约"将为所属领域普通技术人员理解并且在一定程度上将取决于 其使用的情况而变化。如果使用所属领域普通技术人员不清楚的术语，那么考虑到其使用 的情况，"约"将意味着达到特定术语的正或负10%。
[0040]术语"烷基"指的是具有规定数目碳原子的直链或分支链饱和烃。举例来说，（C1-C10)烷基意味着包括(但不限于）甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊 基、新戊基、己基、异己基以及新己基等。烷基可未经取代或任选地经一或多个如下文所述 的取代基取代。
[0041 ]术语"烯基"指的是具有规定数目碳原子和至少一个双键的直链或分支链不饱和 烃。（C2-Ciq)烯基的实例包括(但不限于）乙烯、丙烯、1-丁烯、2-丁烯、异丁烯、仲丁烯、1-戊 稀、2-戊稀、异戊稀、1-己稀、2-己稀、3-己稀、异己稀、1-庚稀、2-庚稀、3-庚稀、异庚稀、1-辛 烯、2-辛烯、3-辛烯、4-辛烯以及异辛烯。烯基可未经取代或任选地经一或多个如下文所述 的取代基取代。
[0042]术语"炔基"指的是具有规定数目碳原子和至少一个三键的直链或分支链不饱和 烃。（C2-Ciq)炔基的实例包括(但不限于）乙炔、丙炔、1-丁炔、2-丁炔、1-戊炔、2-戊炔、1-己 炔、2-己炔、3-己炔、1-庚炔、2-庚炔、3-庚炔、1-辛炔、2-辛炔、3-辛炔以及4-辛炔。炔基可未 经取代或任选地经一或多个如下文所述的取代基取代。
[0043]术语"烷氧基"指的是具有规定数目碳原子的-0-烷基。举例来说，（C1-C6)烷氧基包 括-〇-甲基、-〇-乙基、-〇-丙基、-〇-异丙基、-〇-丁基、-〇-仲丁基、-〇-叔丁基、-〇-戊基、-〇-异 戊基、-〇-新戊基、-〇-己基、-〇-异己基以及-〇-新己基。
[0044]术语"芳基"指的是3到14元单环、双环、三环或多环芳香族烃环系统。芳基的实例 包括萘基、芘基和蒽基。芳基可未经取代或任选地经一或多个如下文所述的取代基取代。 [0045]单独或作为另一取代基的部分的术语"亚烷基"、"亚烯基"和"亚芳基"分别意味着 衍生自以下的二价基团：烷基、环烷基、烯基、芳基或杂芳基，如-CH 2CH2CH2CH2-所示范。对于 亚烷基、烯基或芳基连接基团，未暗示连接基团的方向。
[0046] 术语"卤素"和"齒基"指的是-F、-C1、-Br或-工。
[0047] 术语"杂原子"意味着包括氧(0)、氮(N)和硫(S)。
[0048] "羟基"指的是-OH基团。
[0049]术语"羟基烷基"指的是具有规定数目碳原子的烷基，其中烷基的氢原子中的一或 多个置换为-OH基团。羟基烷基的实例包括(但不限于）-〇120!1、-〇12〇120!1、-〇1 2〇12〇120!1、-CH2CH2CH2CH2OI-CH2CH2CH2CH2CH2OKH2CH2CH2CH2CH2CH2OH 以及其分支链形式。
[0050] 术语"环烷基"指的是单环、双环、三环或多环3到14元环系统，其饱和、不饱和或为 芳香族的。杂环可通过任何杂原子或碳原子连接。环烷基包括如上文所定义的芳基和杂芳 基。环烷基的代表性实例包括(但不限于)环乙基、环丙基、环异丙基、环丁基、环戊基、环己 基、环丙烯、环丁烯、环戊烯、环己烯、苯基、萘基、蒽基、苯并呋喃基以及苯并噻吩基。环烷基 可未经取代或任选地经一或多个如下文所述的取代基取代。
[0051] 术语"腈或氰基"可互换使用并且指的是结合于杂芳基环、芳基环和杂环烷基环的 碳原子的-CN基团。
[0052] 术语"胺或氨基"指的是-NRcRd基团，其中Rc和Rd各自独立地指的是氢、（C1-C 8)烷 基、芳基、杂芳基、杂环烷基、（C1-C8)卤烷基以及(C 1-C6)羟基烷基。
[0053] 术语"烷芳基"指的是心-心烷基，其中C1-C8烷基链的至少一个氢原子置换为芳基 原子，所述原子可任选地经一或多个如下文所述的取代基取代。烷芳基的实例包括(但不限 于）甲基苯基、乙基萘基、丙基苯基以及丁基苯基。
[0054] "芳基亚烷基"指的是二价亚烷基，其中C1