l小时，随后 将反应混合物溶解于氯仿：甲醇的2:1混合物中。使用稀HCl将这一溶液的pH调整到pH 2.0， 并且使用H2O萃取反应混合物。
[0199]有机层经硫酸钠干燥并且通过蒸发去除溶剂获得粗产物形式的标题化合物 CBGVA0
[0200]大规模酶促制造大麻素
[0201] 100ml IOmM磷酸钠缓冲液(pH 5.0)置于装配有氧气鼓泡器和搅拌器的玻璃反应 器中。向这一溶液中添加35g/l 2-羟基丙基-β-环糊精(HPM); KleptoW· HPB)、磺基丁醚β-环糊精钠盐(SBEKD; Cap丨.is〇n或随机甲基化环糊精〇Μβ⑶）。以5g小份添加⑶以确保完 全溶解。
[0202]向缓冲环糊精溶液中添加2.5g大麻素合成酶底物(例如CBGA或CBGV-A)或式I、II 或V化合物。CD比底物的摩尔比为约4:1。向溶液中添加60mg纯化合成酶并且在30°C下培育 反应混合物8小时。通过HPLC定期监测反应进展，并且使用酶分析检测和定量过氧化氢的逸 出。
[0203] 8小时后，超过90 % CBGA底物转化成THCA和CBCA。在酸性pH 5.0下，THCA比CBCA的 比率为约10: UCBC异构体的比率为5:1。
[0204] 用95%Et0H 10:1稀释水溶液。这使环糊精沉淀出来，留下大麻素溶液。环糊精真 空过滤，用IL 90 %EtOH洗涤，并且干燥以允许其重新用于未来反应。将残余物悬浮于DCM: 氯仿(4:1)溶剂中之后，浓缩含有大麻素的乙醇溶液获得约25g粗橙色-黄色残余物。
[0205]大规模纯化大麻素
[0206] 使用LH-20亲脂性树脂色谱纯化使用这一技术的方法合成的大麻素。简单来说， 4000g树脂使用20L DCM:氯仿(4:1)溶胀。溶胀树脂在44 X 2.75cm柱中重力装填。溶胀树脂 的体积为约1350mL。用25g溶解于最少量溶剂中的粗残余物装载柱，并且接着用4L DCM:氯 仿(4:1)溶剂洗涤来洗脱CBG。这一洗脱期间无大麻素酸从柱洗脱出来。
[0207] 用1:1到0:1DCM:丙酮溶剂梯度洗脱来洗脱大麻素酸。梯度的各步骤使用一种溶剂 柱体积(4L)。首先洗脱CBCA，随后CBGA，并且接着THCA。各大麻素的纯度为>99.5 %。
[0208]纯大麻素可通过在90°C下在真空下加热酸形式进一步加工成其中性或"活性"形 式。定量脱羧获得中性大麻素。必要时，可进行再结晶以获得医药级大麻素。
【主权项】
1. 一种制造大麻素或大麻素类似物的方法，其包含W下步骤： (a) 选择根据式I的化合物；(b) 选择大麻素合成酶作为将所述式I化合物转换成所述大麻素或大麻素类似物的催 化剂； (C)使所述式I化合物与所述大麻素合成酶在溶剂存在下反应； (d) 分离来自步骤(b)的产物；W及 (e) 任选地使来自k)的产物脱簇； 其中 R选自-OH、面素、-甜或-NRaRb基团； Ri和R2各自独立地选自由W下组成的群组:寸、-(：(0化、-(?3、任选经取代的(：1-(：1追链 或分支链亚烷基、任选经取代的C2-C10直链或分支链亚締基、任选经取代的C2-C10直链或分 支链亚烘基、任选经取代的C3-C10芳基、任选经取代的C3-C10环烷基、（C3-C10)芳基-(Ci-Cio) 亚烷基、（C3-C10)芳基-(C2-C10)亚締基W及(C3-C10)芳基-(C广Cio)亚烘基，或 Ri和R2连同其键结的碳原子一起形成Cs-Cio环状环； 化选自由W下组成的群组:H、-C(0)RaW及Ci-Cio直链或分支链烷基；W及 Ra和化各自独立地是-H、-OH、-SH、-畑2、（Ci-Cio)直链或分支链烷基或C3-C10环烷基； 其前提条件是所述大麻素不是四氨大麻酪或大麻二酪。2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述大麻素合成酶选自由W下组成的群组:大麻二 醇酸合成酶、四氨大麻酪酸合成酶W及大麻环祗酪酸合成酶。3. 根据权利要求1所述的方法，其中所述Cs-Cio环状环包含一或多个选自氧、硫或氮的 杂原子。4. 根据权利要求1所述的方法，其中R2为选自由W下组成的群组的直链亚烷基：CH3、 C2也、C3出、C姐9、C日化1、C巧13、C讯1日U及〔抽17。5. 根据权利要求1所述的方法，其中R2为选自由W下组成的群组的C2-C10亚締基：且R4 为选自由W下组成的群组的直链亚烷基:C也、C2也、C3出、C边9、C5出1、C6出3、C7出5 W及C祖17。6. 根据权利要求1所述的方法，其中R2为选自由W下组成的群组的C2-C10直链或分支链 亚烘基：7. 根据权利要求1所述的方法，其中化为其中X选自-OH、-甜或-NRaRb。8. 根据权利要求1所述的方法，其中R为-OH，Ri为-C00H，R2为Cs出1且R3为-H。9. 根据权利要求2所述的方法，其另外包含使所述大麻素合成酶偶联到固体支撑物。10. 根据权利要求1所述的方法，其中所述大麻素或大麻素类似物为单个对映异构体。11. 根据权利要求10所述的方法，其中所述大麻素或大麻素类似物的对映异构纯度为 至少95 %。12. 根据权利要求10所述的方法，其中所述大麻素或大麻素类似物的所述对映异构纯 度为至少99 %。13. -种制造根据式II的大麻素或大麻素类似物的方法，所述方法包含W下步骤： (a) 使根据式ΙΠ 的化合物与根据式IV的化合物；在催化所述式ΠΙ化合物与式IV化合物反应的酶存在下反应W形成式II化合物；(b) 使所述式II化合物与大麻素合成酶在溶剂存在下反应； (C)分离来自步骤(b)的产物；W及 (d)任选地使来自k)的产物脱簇获得所述大麻素或所述大麻素类似物； 其中 R选自-OH、面素、-甜或-NRaRb基团； 化和R2各自独立地选自由W下组成的群组:-H、-C (0) Ra、-ORa、任选经取代的直链或分支 链(Ci-Ci日)亚烷基、任选经取代的直链或分支链(C2-C1日)亚締基、任选经取代的直链或分支 链(C2-C10)亚烘基、任选经取代的C3-C10芳基、任选经取代的C3-C10环烷基、（C3-C10)芳基- (&-ClQ )亚烷基、（C3-C1Q )芳基-(C2-C1Q )亚締基W及(C3-C1Q )芳基-(C广ClQ )亚烘基，或 Ri和R2连同其键结的碳原子一起形成Cs-Ci肺状环； 化选自由W下组成的群组:H、-C(0)RaW及Ci-Ci追链或分支链烷基； Rs选自由W下组成的群组：直链或分支链(Ci-Cio)亚烷基、直链或分支链（C2-C10)亚締 基、直链或分支链(C2-C1Q)亚烘基、-C(0)-(Cl-ClQ)亚烷基、-C(0)-(C2-CiQ)亚締基W及-C (0)-(C2-ClQ)亚烘基； 其中任何亚烷基、亚締基、亚烘基、芳基、芳基亚烷基或环烷基经一或多个选自由W下 组成的群组的基团进一步取代:-〇H、面素、-NRbRc、-C(O)Ra、-C(O)NRbRc、（C广Cl0)烷基、-CN、 (C1-C4 )烷氧基、（C1-C4)面烷基W及(C1-C4)径基烷基；W及 Ra、化W及Rc各自独立地是-H、-OH、-SH、-N此、（C广Cio)直链或分支链烷基或C3-C10环烧 基。14. 根据权利要求13所述的方法，其中化为选自由W下组成的群组的(C2-C10)亚締基：且民4为选自由^下组成的群组的直链亚烷基：CH3、C油5、〔3化、〔4也、抗出1、〔6出3、〔7&5^及 C 組 17。15. 根据权利要求13所述的方法，其中貼6选自（Ci-Cio)亚烷基、（C2- Cio)亚締基、-OH、-甜、N02、F、C1、Br、-N 出或-NHRa。16. -种用于制造四氨大麻酪、大麻环祗酪或四氨大麻酪和大麻环祗酪两者、或其类似 物的方法，其包含W下步骤： (a) 选择根据式V的化合物；(b) 使所述式V化合物与四氨大麻酪酸合成酶在溶剂存在下反应； (C)改性包含式V化合物和四氨大麻酪酸合成酶的反应混合物的至少一种特性W获得 四氨大麻酪、大麻环祗酪或四氨大麻酪和大麻环祗酪两者或其类似物作为产物； 其中 R选自-OH、面素、-甜或-NRaRb基团； Ri和R2各自独立地选自由W下组成的群组:寸、-(：(0化、-(?3、任选经取代的(：1-(：1〇直链 或分支链亚烷基、任选经取代的C2-C10直链或分支链亚締基、任选经取代的C2-C10直链或分 支链亚烘基、任选经取代的C3-C10芳基、任选经取代的C3-C10环烷基、（C3-C10 )芳基-(Cl-ClO ) 亚烷基、（C3-C10)芳基-(C2-C10)亚締基W及(C3-C10)芳基-(C广Cio)亚烘基，或 Ri和R2连同其键结的碳原子一起形成Cs-Ci肺状环； 化选自由W下组成的群组:H、-C(0)RaW及Ci-Ci追链或分支链烷基；W及 Ra和化各自独立地是-H、-OH、-SH、-畑2、（Ci-Cio)直链或分支链烷基或C3-C1跡烷基。17. 根据权利要求16所述的方法，其中步骤k)包含改变所述反应混合物的pH。18. 根据权利要求17所述的方法，其中所述pH在约4.0到约8.0单位的范围内。19. 根据权利要求17所述的方法，其中特定pH下四氨大麻酪对大麻环祗酪的比率如下 表中所示：〇20. -种用于制造大麻素或大麻素类似物的系统，其包含： 固持培养基和多个细胞的发酵器，其中所述细胞被配置成产生和分泌大麻素合成酶； 含有反应物的生物反应器，所述反应物被配置成与大麻素合成酶相互作用形成第一大 麻素和第二大麻素；W及 控制机构，其被配置成控制所述生物反应器的条件， 其中相对于第二大麻素形成的量，所述生物反应器的所述条件影响所述第一大麻素形 成的量，W及 其中所述第一和所述第二大麻素为天然存在的大麻素或大麻素类似物中的每一者。21. 根据权利要求20所述的系统，其另外包含被配置成至少部分分离所述多个细胞与 所述培养基的过滤器，使得分离后所述培养基含有所述多个细胞产生的大麻素合成酶。22. 根据权利要求20所述的系统，其中所述生物反应器为含有儀的柱式生物反应器，且 其中所述大麻素合成酶包括被配置成结合到儀的标签。23. 根据权利要求20所述的系统，其中所述反应物为根据式I的化合物；其中 R选自-OH、面素、-甜或-NRaRb基团； Ri和R2各自独立地选自由W下组成的群组:寸、-(：(0化、-(?3、任选经取代的(：1-(：1追链 或分支链亚烷基、任选经取代的C2-C10直链或分支链亚締基、任选经取代的C2-C10直链或分 支链亚烘基、任选经取代的C3-C10芳基、任选经取代的C3-C10环烷基、（C3-C10)芳基-(Ci-Cio) 亚烷基、（C3-C10)芳基-(C2-C10)亚締基W及(C3-C10)芳基-(C广Cio)亚烘基，或 Ri和R2连同其键结的碳原子一起形成Cs-Cio环状环； 化选自由W下组成的群组:H、-C(0)RaW及Ci-Cio直链或分支链烷基；W及 Ra和化各自独立地是-H、-OH、-SH、-畑2、（Ci-Cio)直链或分支链烷基或C3-C10环烷基。24. 根据权利要求20所述的系统，其中所述大麻素合成酶为四氨大麻酪酸合成酶。25. 根据权利要求24所述的系统，其中所述第一大麻素为四氨大麻酪酸和大麻环祗酪 酸中的一者并且所述第二大麻素为四氨大麻酪酸和大麻环祗酪酸中的另一者。26. 根据权利要求24所述的系统，其中所述四氨大麻酪酸合成酶与所述生物反应器中 的所述反应物相互作用形成所述第一大麻素和所述第二大麻素两者。27. 根据权利要求20所述的系统，其中所述生物反应器的所述条件随pH、溶剂、溫度、压 力W及流动速率中的至少一者改变。28. 根据权利要求20所述的系统，其中所述生物反应器的所述条件的改变被配置成引 起W下位移:从1)相对于所述第二大麻素 W较大量形成所述第一大麻素到2)相对于所述第 一大麻素 W较大量形成所述第二大麻素。29. 根据权利要求1、13和16中任一权利要求所述的方法，其中所述溶剂为DMS0。
【专利摘要】本发明提供制造大麻素和大麻素类似物的方法以及制造这些化合物的系统。本发明方法针对根据式I或式II的化合物与大麻素合成酶接触。还描述一种用于制造大麻素和大麻素类似物的系统，其通过使THCA合成酶与大麻素前驱体接触并且改性所述反应混合物的至少一种特性以相对于第二大麻素形成的量影响第一大麻素形成的量。
【IPC分类】A61K31/352, A61K9/127
【公开号】CN105555265
【申请号】CN201480023902
【发明人】罗伯特·温尼茨基, 马克·东斯基
【申请人】全谱实验室有限公司
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2014年2月27日
【公告号】CA2902452A1, EP2961402A1, US9359625, US20150361469, WO2014134281A1