使用微rna和egfr-tki抑制剂的联合癌症治疗的制作方法
【专利说明】使用微RNA和EGFR-TKI抑制剂的联合癌症治疗 相关申请
[0001] 本申请要求2013年3月15日提交的美国序列号61/787,558和2014年1月15 日提交的美国序列号61/927, 543申请的优先权，其均通过引用全文并入本文。 序列表
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技术领域
[0003] 本发明涉及癌症治疗，更具体地涉及使用微RNA(microRNA)和EGFR-TKI抑制剂的 联合癌症治疗。
【背景技术】
[0004] 肺癌在男性和女性癌症相关死亡中均占最多数。预期在2012年估计有约220, 000 例肺癌新病例，占全部癌症诊断的约14%(CancerFacts&Figures2012,Society)。肺癌 是癌症相关死亡的主要原因，2012年总数估计有160, 000例死亡，相当于全部癌症死亡的 约28%。肺癌分为两个主要类别。小细胞肺癌（SCLC)影响到20%的患者而非小细胞肺 癌（NSCLC)影响到约80%。NSCLC包括三个主要类型：腺癌、鳞状细胞癌和大细胞癌，其中 肺腺癌和鳞状细胞癌占所有肺癌的绝大部分（参见，例如，Forgacs等人，PatholOncol Res, 2001. 7(1) :6-13;Sekido等人，BiochimBiophysActa, 1998. 1378(1) :F21-59)。治疗 包括手术、放射治疗、化疗和靶向治疗。对于局部NSCLC，手术通常是所选的治疗，并且通过 手术后给予化疗提高了这些患者中大多数的存活率。根据癌症基因型或疾病的阶段使用靶 向治疗，革巴向治疗包括贝伐珠单抗（Avastin?，Genentech/Roche)---种革巴向VEGF-A的 人源化单克隆抗体，埃罗替尼（Tarceva?，Genentech/Roche)---种EGFR酪氨酸激酶抑 制剂（EGFR-TKI)，和克唑替尼（crizotinib) (Xalkori?，Pfizer)--ALK(间变性淋巴瘤 激酶）和R0Sl(c-r〇s癌基因，受体酪氨酸激酶）的抑制剂。克唑替尼已被FDA批准用于治 疗某些晚期（局部晚期或转移性）非小细胞肺癌，并限于表达突变的ALK基因的那些。贝 伐珠单抗已被首次批准在一线晚期非鳞状NSCLC中与卡铂/紫杉醇化疗联合使用。此后， 美国国家综合癌症网络（NationalComprehensiveCancerNetwork)推荐贝伐珠单抗作为 与任何基于铂的化疗相联合的标准一线治疗，随后维持贝伐珠单抗直至疾病进展（Sandler 等人，NEnglJMed, 2006. 355 (24) : 2542-50)。
[0005] 埃罗替尼获得了美国食品和药物管理局（FDA)的快速通道批准，用于在先前 的传统化疗方案失败后的NSCLC患者（Cohen等人，Oncologist, 2005. 10 (7) : 461-6 ; Cohen等人，Oncologist, 2003. 8 (4) : 303-6)。它是EGFR激酶的可逆抑制剂，被设计 为充当在EGFR激酶的活性位点处的ATP结合的竞争性抑制剂（Sharma等人.NatRev Cancer，2007. 7 (3) : 169-81)。吉非替尼是在美国之外的国家中使用的另一种EGFR-TKI 药剂。虽然不存在比较吉非替尼与埃罗替尼的直接对比效果试验，但数据表明它们之间 没有大的治疗差异（Pao等人，NatRevCancer, 2010. 10(11) :760-74)。使用EGFR-TKI 的早期临床试验在一定程度上是令人鼓舞的，其中在约10-20%的接受治疗的NSCLC患 者中观察到部分反应（Fukuoka等人.JClinOncol, 2003. 21 (12) :2237-46)。药物 反应更常发生于女性、从不吸烟者、亚裔患者和诊断为腺癌或具有支气管肺泡组织学 的那些人（Fukuoka等人，JClinOncol, 2003. 21 (12) :2237-46;Bell等人，JClin Oncol，2005. 23(31) :8081-92)。值得注意的是，这两种药物仅使患者总体存活期延长约2 个月，它们由于原发性或获得性的继发性抗性而失去功效（Sharma,同上；Shepherd等人，N EnglJMed, 2005. 353 (2) : 123-32)。
[0006] 吉非替尼和埃罗替尼的不够理想的反应率已引发了多项研究来评估反应性与抗 性患者人群的遗传背景。临床试验的追溯分析揭示，EGFR表达水平与对吉非替尼的反应 不相关（Bell，同上）。相反，对所述药物有反应的患者经常在EGFR激酶结构域中具有激 活突变（同上）。然而，少于50%的具有EGFR突变的患者产生反应，表明还存在另外的决 定对EGFR-TKI的敏感性的因素。原发性抗性或继发性抗性与以下因素相关：（l)K-RAS突 变，它可与EGFR突变共同存在，尽管K-RAS与EGFR突变似乎是显著相互排斥的（Gazdar 等人，TrendsMolMed, 2004. 10 (10) :481-6;Pao等人，PLoSMed，2005.2(l):el7); (2)c-Met( -种向PI3K途径发信号的受体酪氨酸激酶）的扩增和超表达，代替EGFR 的失活（Engelman等人，Science, 2007. 316(5827) :039-43) ; (3)EGFR的催化域中第 二突变的获得（通常是T790M)(Pao等人·PLoSMed, 2005. 2 (3) :e73)，（4)BRAF突变 (Pratilas等人，CancerRes，2008.68(22):9375-83) ;(5)ALK易位（Shaw等人，JClin Oncol, 2009. 27(26):4247-53) ; (6)肝细胞生长因子（HGF)超表达，其为MET受体的配 体（Yano等人，CancerRes, 2008. 68(22) :9479-87) ; (7)其他EGFR突变的存在（在外显 子 20 中的小插入或复制：D770_N771、insNPG、insSVQ、insG和N771T)(Wu等人，Clin CancerRes, 2008. 14(15):4877-82);以及（8)影响EGFR下游的信号传导的遗传损伤，包 括PIK3CA(Engelman等人，JClinInvest, 2006. 116(10) :2695-706;Kawano等人，Lung Cancer, 2006. 54 (2): 209-15)，PTEN(Sos等人，CancerRes, 2009. 69 (8) :3256-61)、IGF1R 和KDM5A(Gong等人，PLoSOne, 2009. 4(10)e7273;Sharma等人，Cell. 141(1) :69-80)的损 失。T790M突变发现于约50%的具有获得性抗性的EGFR突变肿瘤中；KRAS突变发生于全部 NSCLC的15-25%中；突变的BRAF和ALK易位分别发现于2-3%和5%的NSCLC中（Pao等 人，NatRevCancer, 2010. 10(11) :760-74)。因此，有可能对EGFR-TKI治疗有反应的NSCLC 患者的百分比相对较小。可能存在介导对EGFR抑制剂的抗性的其他尚未鉴定的分子决定 因素。
[0007] 作为单一治疗剂的埃罗替尼的适度功效要求这些EGFR-TKI与其他治疗方案联 合使用。ΠΙ期临床试验TRIBUTE/TALENT试验（其研究埃罗替尼与顺铂/吉西他滨或 卡铂/紫杉醇组合的效果）未能证明该药物相对于单独的传统化疗的存活益处（Sharma， 同上；Herbst等人，JClinOncol, 2005. 23(25) :5892-9 ;以及Giaccone等人，JClin Oncol, 2004. 22(5) :777-84 ;以及Herbst等人，JClinOncol, 2004. 22(5) :785-94)。因 此，目前正在将埃罗替尼与在临床前研究中显示有前景的结果的其他靶向小分子抑制剂组 合进行测试，这样的抑制剂抗mTOR和MET(Pao,同上）。该策略在具有EGFR-TKI抗性的患 者中是否有效仍有待确定。可获得的数据表明抗性肿瘤由在已经携带抗性基因的突变的未 经处理的肿瘤中的稀有细胞引起，而这些亚群被选择用于TKI治疗的整个过程（同上）。也 有可能未经处理的肿瘤已经显示出EGFR-TKI抗性细胞的异基因谱，表明靶向治疗的单一 药物组合将不足以用于有效治疗。相反，若干组合的顺序使用对于消除在先前治疗过程中 经历阳性选择的抗性肿瘤可能是必要的。
[0008] 因此，尽管在肺癌的治疗中已取得进展，但肺癌患者的存活率仍然极低。目前的靶 向治疗诸如EGFR-TKI前景可观，但由于原发性和继发性抗性的存在或发展而在单一治疗 中缺乏满意的功效。EGFR抑制剂与其他靶向治疗的联合使用可有助于EGFR抑制剂的功效， 并且可以帮助克服或阻止抗药性。
[0009] 初步研究表明，某些miRNA可在体外使癌细胞致敏（在Bommer等人，Curr Biol, 2007. 17 (15) : 1298-307中评述）。例如，let-7能够使肺癌细胞对基于TRAIL的吉西他 滨或放射治疗敏感（Li等人，CancerRes, 2009. 69 (16) : 6704-12 ;0vcharenko等人，Cancer Res, 2007. 67(22):10782-8;Weidhaas等人，CancerRes, 2007. 67(23):11111-6)。类 似地，miR-34提高了传统治疗在前列腺、结肠、脑、胃、膀胱和胰腺的癌细胞系中的功 效（Fujita等人，BiochemBiophysResCommun, 2008. 377(1):114-9;Ji等人，PLoS One, 2009. 4(8) :e6816;Kojima等人，Prostate. 70(14) :1501-12.Akao等人，Cancer Lett.300 (2):197-204;Weeraratne等人，NeuroOncol. 13(2):165-75Ji等人，BMC Cancer, 2008. 8:266;以及Vinall等人，IntJCancer，2011.130(ll):2526-38)。然而，仍 然不存在任何埃罗替尼/miRNA组合在肺癌的细胞和动物模型中的示例。
[0010]近来，Zong等人（Chemico-BioInterac. 2010, 184:431-438)已经测试了let_7a、 miR-126和miR-145使吉非替尼抗性细胞系A549和H460对吉非替尼敏感的能力。IC5。的最 大降低通过H440细胞中的miR-126而实现（约7倍），而其余的条件仅导致IC5。降低2-3 倍（参见Zhong(同上）中的表2) 〇
【发明内容】
[0011] 本发明部分地基于以下发现：某些微RNA可在EGFR-TKI抗性细胞系中一致地上调 或下调，以及微RNA和EGFR-TKI药剂的特定组合可具有有利的和/或出乎意料的结果，例 如由于它们在处理某些癌细胞中尤其有效（例如，协同作用或具有大于累加效应的效果）。 因此，本发明在各个方面和实施方案中包括使细胞、组织和/或生物与微RNA和EGFR-TKI 药剂的特定组合相接触。更具体地，本发明可包括使癌细胞、癌组织和/或患有癌症的生物 与微RNA和EGFR-TKI药剂的这样的组合相接触。所述方法可以是实验性的、诊断性的和 /或治疗性的。所述方法可用于抑制或减少细胞（包括组织或生物中的细胞）的增殖。微 RNA可以是例如在EGFR-TKI抗性细胞系中一致地下调或上调的微RNA的模拟物或抑制剂。
[0012] 因此，在各个方面和实施方案中，本发明提供了治疗患有癌症的受试者的方法。在 某些实施方案中，该方法包括：向所述受试者施用EGFR-TKI药剂，以及向所述受试者施用 miR-34、miR-126、miR-124、miR-147和miR-215的微RNA模拟物。类似的方法包括：使细胞 或组织（例如，癌细胞或癌组织如肿瘤）与EGFR-TKI药剂相接触（例如，处理），以及使所 述细胞或组织与miR-34、miR-126、miR-124、miR-147和miR-215的微RNA模拟物相接触。 所述微RNA可包含与SEQIDN0:1-6 和 168-179 (miR-34、miR-126、miR-124、miR-147 和 miR-215,及其家族成员、功能同源物、种子序列或共有序列）中的至少一个至少80% (或 85%、90%、95%、100% )相同的序列。这些以及其他微RNA可包含天然核酸、其衍生物和 化学修饰形式以及核酸类似物。
[0013] 在各个方面和实施方案中，本发明提供了向受试者（例如，患有癌症的受试者）施 用EGFR-TKI药剂以及向所述受试者施用在附录A中以SEQIDN0:8-122列出的微RNA(下 调的微RNA)的微RNA模拟物的方法。类似的方法包括使细胞或组织（例如，癌细胞或癌 组织如肿瘤）与EGFR-TKI药剂相接触，以及使所述细胞或组织与在附录A中以SEQID NO: 8-122列出的微RNA(下调的微RNA)的微RNA模拟物相接触。该微RNA可包含与SEQID NO:8-122中的至少一个至少80% (或85%、90%、95%、100% )相同的序列。
[0014] 在各个方面和实施方案中，本发明提供了向受试者（例如，患有癌症的受试者）施 用EGFR-TKI药剂以及施用在附录A中以SEQIDN0:123-167,优选SEQIDN0:156-167,更 优选SEQIDNO: 159、164和165列出的微RNA(上调的微RNA)的抑制剂的方法。类似的方 法包括使细胞或组织（例如，癌细胞或癌组织如肿瘤）与EGFR-TKI药剂相接触，以及使所 述细胞或组织与在附录A中以SEQIDN0:123-167,优选SEQIDN0:156-167,更优选SEQ IDNO: 159、164和165列出的微RNA(上调的微RNA)的抑制剂相接触。该抑制剂可以是包 含与微RNA至少80% (或85%、90%、95%、100% )互补的序列的微RNA。
[0015] 在各个实施方案中，所述EGFR-TKI药剂可以是埃罗替尼或类似的EGFR-TKI药剂 如吉非替尼、阿法替尼、帕尼单抗或西妥昔单抗，或HER2抑制剂如拉帕替尼、培妥珠单抗或 曲妥珠单抗。在一些实施方案中，所述EGFR抑制剂是埃罗替尼，并且所述微RNA与SEQID NO: 1-4 中的一个，例如SEQIDNO: 1 至少 80% (或 85%、90%、95%、100% )相同。
[0016] 在各个实施方案中，所述癌症可以是其中根据本发明的微RNA和EGFR-TKI抑制剂 的组合是对其有效的治疗的癌症，例如肺癌（例如，非小细胞肺癌，NSCL)和肝癌（例如，肝 细胞癌，HCC)。所述癌症可包括肝的转移性病变。
[0017] 在各个实施方案中，所述癌症可以对单独采用EGFR-TKI药剂的治疗具有抗性。所 述抗性可以是原发性或继发性的（获得性的）。所述癌症可以是对单独采用EGFR-TKI药 剂的治疗具有原发性或继发性抗性的肺（例如，NSCL)癌。所述癌症可以是对单独采用 EGFR-TKI药剂的治疗具有原发性或继发性抗性的肝癌（例如，HCC)。
[0018] 在各个实施方案中，所述EGFR-TKI药剂可以以有效剂量施用，该有效剂量比在不 存在微RNA施用的情况下有效所需的剂量低（例如，低至少50% )。所述剂量可以是在不存 在微RNA的情况下所必需的剂量以下5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、 50%、60%、70%、80% 或 90%。
[0019] 在各个实施方案中，所述EGFR-TKI药剂的IC5。相对于在不存在微RNA施用的情况 下的IC5。降低（例如，至少2倍）。所述1C5。可降低至少L5、2、2. 5、3、4、5或10倍。
[0020] 在各个实施方案中，所述受试者是人、非人灵长类动物或实验动物（例如，小鼠、 大鼠、豚鼠、兔、猪）。所述受试者可具有KRAS突变。所述受试者可具有EGFR突变。在一些 实施方案中，所述受试者对埃罗替尼具有原发性或继发性抗性，例如，已发展或有可能发展 对EGFR-TKI药剂的抗性的患者。或者，所述受试者的癌症可对EGFR-TKI药剂足够敏感，然 而，单一治疗的这种毒性可表明较低剂量的EGFR-TKI药剂是理想的。
[0021] 本发明的各个方面、实施方案和特征在下文中进行了更详细的说明和描述。然而， 如所声称的，前文和以下描述仅是说明和解释性的，并非对本发明的限制。